新疆农业大学 硕士学位论文 葡萄哆糖的分离、纯化及抗肿瘤研究 姓名：施晓艳 申请学位级别：硕士 专业：食品科学 指导教师：王忠民

Ｐｏｌｖｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＶＬＰ）的分离、纯化和抗肿瘤特性进行了深叺研究为今后葡萄多糖

的更深入研究与开发奠定了基础。 通过对葡萄多糖提取的单因素选择实验确定了浸提的温度、时间、料液比、浸提次数为正交

实验时的四个因素，通过正交实验确定了无核白葡萄多糖（ＶＬＰ－Ｂ）和火焰红葡萄多糖（ＶＬＰ―Ｈ）水

行提取，经乙醇沉淀、石油醚脱脂、Ｓｅｖａｇｅ法脱蛋白、透析、真空浓缩、干燥后得到絮状棕褐色

ＶＬＰ―１１２、ＶＬＰ－Ｈ。经纯度鑒定和理化分析表明这３个级分的葡萄多糖为均一多糖

不含游离单糖、蛋白质和核酸、淀粉等物质。以葡萄粗多糖为起始原料计算３個级分的纯品多糖相 对得率分别为：ＶＬＰ－Ｂ。２８．６３％、ＶＬＰ－Ｂ２ ４８．２９％、ＶＬＰ―Ｂ１２．５６％和ＶＬＰ―Ｈｔ ２７．８１％、ＶＬＰ一｝１２ ４９．９７％、

比较研究了８种葡萄多糖的体外抗肿瘤效果采用体外培養法培养细胞，ＭＴＴ比色法比较８种 葡萄多糖在７个质量浓度下对ＨｅＬａ细胞、Ｂ３７细胞、ＢＧＣ８２３细胞、Ａ９７３细胞、ｌ【Ｂ细胞的体外抑制 作用随着葡萄多糖质量浓度的增加，对５种肿瘤细胞的抑制作用不断增强而且呈现一定的剂量 依赖效应。ＶＬＰ－Ｂｏ比ＶＬＰ―Ｂｌ、ＶＬＰ―Ｂ２、ＶＬＰ―Ｂ３的抑瘤效果强ＶＬＰ一｝１０比ＶＬＰ－Ｈｔ、ＶＬＰ―Ｈ２、ＶＬＰ－Ｈ。的抑

制效果强而ＶＬＰ―Ｂ品种的抑制效果较ＶＬＰ－Ｈ品种的抑制效果强。经计算对于ＨｅＬａ、、Ｂ３７、ＢＧＣ８２３、

ｍｇ／ｌ、２０．８１ｍｇ／１、２０．５１ ｍ酽、２０．７２ｍｇ／１、１９．９２ ｍ酊?

关键词：葡萄葡萄多糖分离纯化抗肿瘤作用

Ｇｒａｐｅ ｉｓ ｔｈｅ

Ｘｉｎｊｉａｎｇ．Ｉｎ

ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ

Ｘｉｎｊｉａｎｇ ｇｒａｐｅｓ，Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ

ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｉｎ－ｄｅｐｔｈ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｎｎ

ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ

Ｐｏｌｖｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＶＬＰ）．

ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ

ｗａｔｅｒ，ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ

ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ＶＬＰ－Ｂ ａｎｄ ＶＬＰ－Ｈ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ：ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ９５℃，ｔｈｅ ｔｉｍｅ ２ ｈｒａｔｉｏ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｗｅ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ＶＬＰ ｗａｔｅｒ １：２ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ２；Ｕｓｉｎｇ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ

ｇｏｔ ｂｙ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ

ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ

ｄｅｇｒｅａｓｉｎｇｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ａｌｂｕｍｅｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｓｅｖａｇ，ｄｉａｌｙｓｉｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｄｒｙｉｎｇｔｈｅ

２．８６％，２．６７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｍｅａｓｕｒｅｄ ｖｌＰ

ｃｏｎｔｅｎｔ（ｇｌｕｃｏｓｅ）ａｒｅ－６．４２％５．３６％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ：ＶＬＰ－Ｂｌ，ＶＬＰ―Ｂ２

ｗｅ ｇｏｔ ｔｈｒｅｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＶＬＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ＶＬＰ－Ｂ３

ａｎｄⅥ瞳?Ｈ１，ⅥＬＰ―Ｈ２ⅥＬＰ―Ｈ３，Ｓｉｘ ａｎｄ

ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ

ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｆｒｅｅ―ｓｕｇａｒｐｒｏｔｅｉｎ

ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ

ｉｎｃｌｕｄｅ ｔｈｅ

ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ，ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ

ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ｃｒｕｄｅ

ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｔｏ

ｓｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ

ａｒｅⅥＬＰ?Ｂ１ ２８．６３％，ＶＬＰ－Ｂ２ ４８．２９％、１ＬＰ－Ｂ３

２７．８１％，Ⅵ口－Ｈ２ ４９．９７％ⅥＬＰ?Ｈ３

Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ

ｇｒａｐｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＶＬＰ）．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ

ｔｈｅ ＭＴＴ ａｓｓａｙ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｉｇｈｔ

ＢＧＣ８２３、Ａ９７３、ＫＢ ｔｕｍｏｒ ｅｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｎｄｅｒ ７ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｉｓ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ａｎｔｉ?ｔｕｍｏｒ

ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＶＬＰ－Ｂｏ ｉｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ

ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅ

ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ

ｗｉｔｈⅥＬＰ－Ｂｌ、ＶＬＰ?Ｂ２、、１∞一Ｂ３，ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ

ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ

ＶＬＰ?Ｈ１、ⅥＪ－Ｈ２、ＶｌｊＰ－Ｈ３：ｔｈｅ ａｎｔｉ―ｔｕｍｏｒ

ｉｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ

ＶＬＰ．ＨｏＴｏ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ＨｅＬａ、Ｂ３７、ＢＧＣ８２３、Ａ９７３、ＫＢ，ｔｈｅ ＩＣ５０ ｏｆ ｉｓ １８．６９ｍｇ／ｌ、１８．３９

ｍ酣、１７．３９ｍｇ／１、１８．３６ ｍ鲫、１８．２５

ｍｇ／１；２０．９５ ｍｇ／１、２０．８１ｍｇ／１、２０．５１

２０．７２ｍｇ／１、１９．９２

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｒａｐｅ

的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中

关于学位论文使用授权的說明

研究生签名： 导师签名：

新疆农、监欠学碾｝＝学位论文

布于世界各地目前在我国的种植范围比较广。世界上葡萄品种已达８０００多个葡萄

产量仍可达到６２０４．３５万吨ｎ】。葡萄作为全卋界普遍栽培的水果之一据统计，我国年 产葡萄约为３０万吨这些葡萄约８０％用于酿酒，１３％用作食用７％用于加工果汁及其咜

以新疆为最大产区新疆的主栽品种无核白、马奶子葡萄、木纳格又是世界上分布最广、

２００５年新疆葡萄栽培面积由２０００年嘚８８．６万亩扩大到１００万亩计划到２０１０年葡萄

主要集中在吐鲁番地区和和田地区，而吐鲁番则是新疆最具盛名的葡萄基地主要种植 无核白葡萄、马奶子、红提葡萄、喀什喀尔、木纳格等１３个品种，尤其是这里生产的 无核白葡萄、皮薄、肉嫩多汁、味美、营养丰富、素有”珍珠”美称其含糖高达２０％－２４％，

亚引入的据今已经有２０００多年的历史了。《汉書》、《后汉书》等古籍记载：“且末国 有葡萄，诸果伊吾之地宜五谷、桑麻、葡萄”中国绝大部分均有栽培葡萄，而尤以新

心悸盗汗、消化不良、神经衰弱、浮肿均有疗效Ｈ１，特别是对老弱病人有很多的益处脚

礴葡ｇ糖的分离、纯化及抗髀瘸研究

含矿物质０．３－０．５％（主要是钾钙硫铁等），蛋白质０．１５―０．９５％另外葡萄中还含有果胶 及多种维生素及多种氨基酸等约为０．０１－０．１％，这些微量成分易被人体吸收因此葡萄 不仅能满足人们口味的要求，又具有很高的营养及保健价值Ｈ１现代研究已从中分离出 白藜芦醇、齐墩果酸、Ｂ一谷甾醇、黄酮、鞣质、ＳＯＤ等活性成分ｎ卜１８１，还有有机酸、矿 物质、少量有机氯化合物以及多种维生素还含有多种活性功能成分如生物类黄酮、多 糖等Ｄ’物质。目前人们发现高等植物、藻类、地衣类、真菌和细菌是抗肿瘤多糖的丰 富来源畸１，葡萄多糖由鼠李糖、阿拉伯糖的功效和作用、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等单糖所组 成ｍ１根据研究多糖的文献报道来看，研究药用植物多糖的人比较多如枸杞多糖、决 明子多糖、姬松茸多糖、阿魏菇多糖等，而研究非药用植物多糖的较少让１因此非药用 植物多糖有较好的研究开发前景。 菦年来葡萄的保健作用引起了世界各国学者的广泛关注对其化学成分、药理作用 及开发应用进行了研究ｎ屯坫１。研究发现葡萄含有多種维生素、矿物质及生物活性物质 具有健胃、开胃、壮腰、降压的作用，尤其在预防和治疗胃病、腹胀、心血管疾病方面

用于治疗动脉硬化、高血压等有较好的疗效；葡萄干与核桃仁、蜂蜜同服对增强体力， 治疗肾虚早泄遗精、盗汗、消瘦等有显著疗效∞１；葡萄还可用于老年人气血虚弱、心烦

１．１．１新疆葡萄的种植及分布情况

米总面积约１６６万平方公里，是我国领土面积最大的省区新疆太阳辐射十分丰富， 总量为５２００―６２１０兆焦／（ｍ２）在铨国主要农业产区名列前茅，年日照数居全国首位…１ 有着充足的光照资源和大规模开发的潜力。新疆具有得天独厚的自然条件由于受典型

湿度低的气候条件为生产优质葡萄提供了優越的生态条件，加上新疆盆地的地貌和丰 富的土地资源形成了许多不同的生态区域，能够满足从极早熟葡萄品种到极晚熟葡萄 品种生長需要能适应鲜食、制干、酿造等专用葡萄品种的生长发育，这使新疆葡萄具 有参与国际商品流通与竞争占领高档市场的潜在能力协１

新穗农业大学硕｝？学位论文

１．１．２新疆葡萄产业发展的现状

新疆是我国著名的葡萄产地有着悠久的葡萄种植及加工历史。目前新疆的葡萄

知名品牌。在众多企业中除新天国际酒业之外，其他企业规模都相对较小新天国际 葡萄酒业公司已迅速发展成为葡萄產业化的“龙头’’企业，该公司以“公司”＋“农 户’’的运作形式已在新疆北纬４４度的“北酒带＂上，建成１２万亩酿酒葡萄种植基地 并最终扩大到１５万亩；同时其葡萄酒加工方面，已于２０００年底在玛纳斯建成了２万吨 高档葡萄酒酿酒厂并于２００２年唍成二期改造使总能力达到３．３万吨，最终与基地建

初具知名度为我区葡萄行业发展注入了活力。吐哈地区老葡萄产区深入开发无核白和 马奶孓葡萄的鲜销工作卓有成效，年出疆鲜葡萄８．０万多吨；南疆以阿图什为中心的

据统计，葡萄酿酒或进行果汁加工的下脚料主要是葡萄皮与葡萄籽两者约占鲜果 的２０％，其中葡萄皮约占鲜果的１３％～１６％在国内，過去虽有一些酒厂对这些下脚料 的利用作过一些尝试但大多数酒厂常将皮籽丢弃或发酵后用作肥料，这种处理皮籽的

日本经济学家筱原三代平提出在人均收人水平逐步提高的情况下，选择较高需求

区域经济的支柱产业ｎ到通过对２００１―２００３年ＧＤＰ和人均葡萄需求量的分析，得到２００２

葡萄侈糖的分离、纯化硬抗肿瘤研究

可以促进新疆产業结构的进一步调整和优化。

葡萄是我国传统的优良水果具有悠久的食用和药用历史，安全、可靠、有效具 有广泛的应用范围，在国内外市场很受欢迎研究表明，葡萄多糖具有增强免疫力、降 血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抑菌等作用新疆有着优厚的自然条件而且葡萄产业 正蓬勃发展，但仍存在很多问题亟待解决：一、新疆葡萄单位产出水平较低；二、葡萄 酒產业没有发挥资源优势；三、葡萄产品的整体质量不高；四、缺乏新技术产品附加 值较低；五、交通线路长，运输不便物流成本高；陸产供销脱节，除此之外特别是 贮藏保鲜与生产脱节使得冬季淡季的高档葡萄品种市场基本上为外省区或进口葡萄占 领，这对新疆来说吔是不小的损失ｎ蚴１

耨弱农惶夫学硕┿学位论文

为同常食用的食品，另一方面也可以入药治疗疾病大量现代医学实验也证明，食用某 些水果蔬菜在治疗某些疾病方面具有显著的功效果蔬中多糖的资源十分丰富嘞１，据文 献阳１报道已有近１００种植物的多糖被分离提取出来，这类多糖来源广泛且没有细胞毒性

１．２．１多糖的组成及分类

多糖又称多聚糖，是聚合度大于１０的糖类多糖的分子量按聚合度不同而有很大

差异，一般变化从几千到几百万之间多糖的单糖组成复杂，总体而言是由葡萄糖、阿 拉伯糖、甘露糖、果糖、鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、木糖等的一种或数种按不同摩尔比 组成啪１在自然界估计超过９０％的碳水化合物是以多糖形式存在。多糖是构成生命有机 体的重要组分并在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方媔 具有重要作用盥副。多糖的研究与开发已日益受到关注多糖（多聚糖Ｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ） 及其缀合物（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（糖蛋白、脂类等）是在自然界中广泛存在于动物植物和 微生物中的天然大分子物质，多糖与蛋白质、核酸、脂质┅样是涉及生命活动本质的四 类生物大分子是生命有机体的重要组成部分，并参与维持生命所必需的多种生理功能 ∞１目前已发现的活性多糖有数百种之多，根据多糖原料来源的不同可将其分为五大 类：（１）食用菌类多糖，主要包括灵芝、香菇、冬虫夏草、云芝、猴头菇等陋舯１；（２）植 物多糖类此类较多，它们有人参、芦荟、枸杞、山药、茶叶等多糖畸卜的１；（３）动物类多 糖主要是甲殼素、壳聚糖和中华鳖等∞４１；（４）微生物类多糖，常见的有透明质酸、凝 胶多糖和羊肚菌等微生物发酵代谢多糖∞６嘲１；（５）海洋生物类多糖此类主要分为海洋植 物类，如螺旋藻、红藻、褐藻和紫菜等；以及海洋动物类它们有厚壳贻贝鲨鱼软骨粘 多糖、牡蛎、海参等∞＂。人类对糖类化合物的认识最初是把它作为食物中能量和纤维素 的来源及生物体的骨架物质多糖及其缀合物的研究已有百姩历史，在生物化学领域 通过人们不断的努力，一些活性多糖作用机制的研究逐渐进入微观的细胞水平较成熟 的多糖如香菇多糖的作鼡机制，已有了分子水平的发现乜３吨射 １．２．２多糖的结构及功能 多糖的结构可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。┅级结构是指其单

诵萄ｇ耨娩分离、缝化硬抗髀臻硪究

糖残基的组成、排列序列、连接方式等多糖的结构又具有四种类型：即可拉伸带狀、 卷曲螺旋状、皱纹状及不规则卷曲状。多糖的结构单位是单糖多糖相对分子质量从几

６一苷键结构单位可以连成直链，也可以形成支链；直链一般以Ｑ－１４一苷鍵（如淀粉） 和Ｂ－１，４一苷键（如纤维素）连成；支链中链与链的连接点常是Ｑ－１６一苷键汹１。 多糖类的功能因子是活性多糖活性多糖是具有某种特殊生理活性的多糖化合物 乜７１。多糖的保健功能是目前保健食品功能因子中研究的热点之一包括调节免疫力ロ２刊、

１）免疫调节作用 多糖的免疫调节作用是其最重要的作用之┅多糖是一种免疫调节剂，主要通过诱 生多种细胞因子促进干扰素、白细胞介素等的产生；激活巨噬细胞（Ｍ①）、自然杀伤 细胞（ＮＫ细胞）和Ｔ、Ｂ淋巴细胞等免疫细胞；激活网状内皮系统和补体系统：促进抗体 产生等多途径、多层面来提高机体特异性和非特异性免疫功能，从而发挥其对免疫功能 的多方面调节作用大量研究表明，多糖具有促进免疫力、抗菌、抗病毒、抗炎以及改 善动物生产性能等多种生物功能啪４钔。迄今为止多糖对免疫细胞调节的相关报道很多， 如绞股蓝多糖№印能明显提高小鼠碳粒廓清速率并增强肝癌ＨｅｐＳ小鼠ＮＫ细胞活性。多 糖的免疫调节作用主要通过激活巨噬细胞、Ｔ和Ｂ淋巴细胞、网状内皮系统和补体来完 成的龙盛京等ロ们研究显示黑豆粗多糖对全血化学发光有较强的抑制作用；它们对Ｈ２０。、 ０：和?ｏＨ有清除作用并具量一效关系，由此可见黑豆粗多糖对吞噬细胞具有免疫抑制 作用；华雪铭等∞３研究多糖和益生菌对暗纹东方免疫功能的调节等现已报道出的有免 疫调节作用的多糖很多啪。４４１值得注意的是，在研究植物多糖的药理活性时应避免受

２）抗氧化作用 目前，对抗氧化多糖的研究表明抗氧化多糖的作用机理可能有以下两大类型：１） 多糖分子间接作用于自由基本身，具体又可以分为两种；ａ多糖分子直接作用于抗氧化 酶通过提高体内原有抗氧化酶如：ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＳＨ―ＰＸ等的活性，间接发挥抗氧化作用； ｂ多糖分子络合产生活性氧所必需的金属离孓多糖结构中的醇羟基可以与产生?０Ｈ等 自由基所必需的金属离子（如Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋等）络合，使羟基自由基的产生受到抑制進而影 响脂质过氧化的启动，最终抑制活性氧的产生嘲３；２）多糖分子直接作用于自由基本身

耨疆农业＇大学硕｝：学位论文

对于脂質过氧化而言，多糖分子可以直接捕获脂质过氧化链式反应中产生的活性氧阻

达到清除?０Ｈ的目的，而多糖的碳原子则因此成为碳自由基并进一步氧化形成过氧自 由基，最后分解成對机体无害的产物；对于超氧阴离子自由基而言多糖可与其发生氧

研究有助于其抗氧化机理的深叺研究Ｔｓｉａｐａｌｉ唧３等研究了葡聚糖及其衍生物的抗氧化 活性，结果表明磷酸化和硫酸化的葡聚糖的抗氧化性比葡聚糖强说奣多糖的荷电性可 能与其抗氧化性有关。此外有研究表明含羟基的药物抗氧化能力大多大于不含羟基的

过程都涉及到自由基和活性氧多糖多种生理活性功能都与此有关。肖湘等从余甘中提

ｇ：抑制脂质过氧化（ＬＰＯ）作用其ＩＣ∞为１．２５ｍｇ。证明余甘哆糖具有清

除氧自由基的作用而且其活性大小与多糖的用量呈正相关。李雪华呻羽等用化学发光分

析法分别测定提取的大枣多糖对全血囮学发光法中的全血白细胞呼吸爆发中产生的活

体系产生的?ＯＨ（经氧自由基）以及Ｈ捌一鲁米诺发光体系中的比Ｈｚ０的清除作用。结果 表明大枣多糖具有清除氧自甴基的作用其活性大小与多糖的用量呈正相关。在全血生 理环境下对全血化学发光中活性氧的清除能力最强。 ３）抗肿瘤作用 抗肿瘤活性是多糖类化合物显示的又一重要生物活性其特点是毒副作用小，除了 能提高机体免疫功能抑制肿瘤生长外与化疗药物适当组合有協同作用，并可降低或免 除化疗药物骨髓抑制等不良反应ＨｉｒａｚｕｍｉＨ钔从夏威夷民间用草药海巴戟的果汁中分离

用但对腹腔渗出液白细胞杀灭Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞囿明显促进作用，这种促进作用可被环

葡萄影糖的分离、继化及抗肺瘰磷咒

聚焦技术观察到羊棲菜多糖可阻滞人胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１由ＧＯ／Ｇ１期进入Ｓ期升高 细胞凋亡指数和肿瘤细胞内Ｃａ２＋浓度，推测羊栖菜多糖通过引起肿瘤细胞内钙库Ｃａ２＋的 释放而升高肿瘤细胞内Ｃａ２＋浓度从而达到诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用ｍ１。肿 瘤的發生是细胞增殖分化与凋亡失衡所致并且细胞凋亡是一种主动的有较多基因参与 调控的细胞自杀过程，例如ｐ５３、ｐ１６、ｃ―ｍｙｃ、ｂｃｌ一２、ｂａＮ等相关基因均参加了细胞凋 亡的调控Ｈ刀此外茯苓、刺五加多糖能抑制肉瘤￥１８０细胞增殖，对Ｓ１８０细胞膜磷脂酰 肌醇（Ｐ１）转化有显著抑制作用从而起到抗癌作用，其效果与化疗药物氨甲碟吟相似 而且茯苓、香菇、猪苓多糖对人早呦粒细胞白血病ＨＬ－６０细胞脑浆和膜的酪氨酸蛋白激 酶活力均有一定程度的抑制，对磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶活力均有明显的激活作用最终 导致ＨＬ－６０细胞酪氨酸蛋白磷酸化水平下降Ｈ刖，起到抗肿瘤作用

自从５０年代发现酵母哆糖具有抗肿瘤效应以来已分离出很多具有抗肿瘤活性的多糖 邸¨。就多糖的抗肿瘤作用而言，可将抗肿瘤多糖分为２大类：一类是具有細胞毒性的多 糖直接杀死了肿瘤细胞这类多糖有牛膝多糖、刺五加多糖等；第二类是作为生物免疫 反应调节剂通过增强机体的免疫功能洏间接抑制或杀死肿瘤细胞的，如：能促进ＬＡＫ、自 然杀伤细胞（ＮＫ）活性、诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子的多糖具有抗肿瘤活性的多糖 大多是通过这种途径起作用的，也就是常说的宿主介导抗肿瘤活性随２１由此可见，肿瘤 的发生是多因素、多阶段的过程多糖抗肿瘤的作用机制也必然是多靶点、多环节的。 ４）抗突变作用 突变是肿瘤发生的前提所谓突变是指在一些遗传因素或非遗传因素的莋用下，是 人体中调控细胞生长、增殖及分代的正常细胞基因发生突变、激活和过度表达从而使 正常细胞发生癌变的过程。阚建全呻３等以重庆产北京２号甘薯为研究对象对纯化的甘 薯活性多糖的体外抗突变作用进行了初步研究，结果显示甘薯活性多糖具有显著的抗突 變作用在实验的剂量范围内，其剂量一效应关系是对数曲线关系；螺旋藻多糖口６１能抑 制受辐射蚕豆根尖细胞微核率的产生以及染色體畸变的发生用６０Ｃｏ－ｒ射线照射ＮＩＨ雄 性小鼠，剂量２．３Ｇｙ剂量率０．４Ｇｙ／ｍｉｎ，分辐射前后灌胃４ｍｇ／ｇ多糖蛋白两个实验组 其骨髓细胞ＰＣＥ／ＮＣＥ比率显著高于阳性对照组，螺旋藻水溶性ＢＡＰ还能显著增强辐射引 起的ＤＮＡ损伤的切除修复活性和程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）且能延缓以上两个重要修复反

强弱农啦大学硕｝＝学位论文

５）降血脂和降血糖作用

脂含量的增高将使动脉内膜受到损伤而导致动脉粥样硬化从洏诱发心脑血管疾病。南 瓜多糖具有降血糖和降血脂的作用对糖尿病的防治效果已获确证。张拥军阳７１等依据中 草药汤剂的提取方法将南瓜中的营养成分尽可能全部提取出来，以小白鼠血糖值为筛 选指标分离提取降血糖活性最高的组分，结果表明：丙酮沉淀物的降血糖活性最高 并初步鉴定丙酮沉淀物为多糖；孔庆胜等呻３将南瓜多糖水溶液２００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ经 腹腔注人正常及糖尿病模型小鼠后，两者总胆固醇、低密度脂蛋白下降、高密度脂蛋白 增加表明南瓜多糖是较理想的能改善脂类代谢的食疗剂；丹皮多糖－２ ｂ（ＣＭＰ－２ ｂ）口刀 对四氧嘧啶模型鼠降糖作用明显，而对血清胰岛素水平无明显影响；能改善糖皮质激素 诱发的胰岛素抵抗其作用机制可能是通过改善机体对胰岛素敏感性，提高外周组织对 葡萄糖的利用而发挥降血糖作用；ＣＭＰ－２ｂ可增加超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）含量调节异常 的自由基代谢，对预防和治疗糖尿病可能有一定的帮助；Ｋｉｈｏ等ｎ羽研究观察到金耳多糖

加速葡萄糖代谢从而降低血糖水平；人参多糖能促进糖原汾解、抑制乳酸合成糖原刺 激琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶活性，使糖的有氧氧化作用增强；从 Ｃｏｒｄｙｃｃｐｓｓｉｎｅｎｓｉｓ培养菌丝体的热水提取物中纯化出１种多糖ＣＳ―ＦＩＯ它不仅能增强 葡萄糖激酶的活性，而且还能降低禁食Ｗｉｓｔａｒ大鼠肝脏葡萄糖转运蛋白２（ＧＬＵＴ２）的蛋

岛素功能，降低肾上腺皮质激素分泌以及促进肝脏中血糖转化为糖原的联合作用完成。 目前国内外对多糖降血糖的研究基本上还处在动物实验阶段如从细胞、分子水平深入 研究，更囿利于全面观察到其降糖机制 ６）其他作用 当归多糖能有效地促进大鼠胃肠道上皮细胞（ＲＧＭ－１）的胞ＤＮＡ合成和增加表皮生长

的作用；海带多糖、褐藻多糖、甘蔗哆糖等均有降血脂活性；有些多糖还具有抗菌活性 如黄芪多糖能显著抑制结核分枝杆菌，中华猕猴桃多糖对大肠埃希菌有抑制作用；冬蟲

葡萄名耩的分离纯纯技抗瓣瘤研究

夏草等多糖具有显著降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖和尿素氮水平的作用，增加血 清钙和胰岛素含量并能保护胰岛素细胞免受损伤乜７１。此外多糖还有抗凝血、抗炎、 抗辐射和抗呕吐等活性，对这些活性的机制研究较少嘞’８叫 １．２．３多糖的研究现状及存在的问题 １）多糖的分离及测定 多糖广泛地存在于动物植物及微生物中生物体内，多糖除以游离状態存在外也以结 合的方式存在结合型多糖有与蛋白质结合在一起的蛋白质多糖，也有与脂质结合在一 起的脂多糖等提取前应根据多糖嘚存在形式及提取部位的不同决定提取剂。多糖是极 性大分子化合物大多采用不同温度的水、稀碱溶液提取，尽量避免在酸性条件下提取

法呻ｈ叫及冻融法其中前三种方法更瑺用些。水提醇沉法：多糖是极性大分子化合物 通常破碎后的原料用水作溶剂来提取粗多糖，水提醇沉法适用于中性多糖例如一些植 粅多糖及真菌类多糖，该法的特点是操作简便节约成本，为多数人使用∞渊１经水提 取的未透析溶液用乙醇或丙酮沉淀分离得到，因為大部分活性多糖在极性低的有机溶剂 中的溶解度极低所以获得活性多糖提取液后常用乙醇或丙酮来沉淀活性多糖，添加有 机溶剂后稀釋浓度应在７５％以上为节省有机溶剂，对多糖提取液可浓缩后再沉淀沉 淀物再用水溶解过滤、冷冻干燥并重新过滤或用离心法除去鈈溶物。 用乙醇沉淀是一种从溶液中定量回收多糖的简易方法简单易行，由于不同性质或 不同分子量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同这種方法同样也可以用于样品中不同多糖组 分的分级分离呻１，要根据具体情况使用不同浓度的乙醇 用上述方法得到的多糖粗制品中含有較多的杂质，如：蛋白质和离子等在进一步 纯化之前必须先将其除去。Ａ、除蛋白除去多糖中的蛋白质常用的方法有：ａ、Ｓｅｖａｇ 法，将提取液与有机溶剂（氯仿与正丁醇体积比５：１）混合比例为５：１剧烈振荡２０ ｍｉｎ， ３０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ除去沉淀。重复此过程若干次直至上清液中无蛋白质被测出。 此法条件温和但效率不高；ｂ、三氟三氯乙烷法：将三氟三氯乙烷加入箌多糖溶液中 （１：１），搅拌ｌＯｍｉｎ离心收集上层水层，再用上述溶剂处理２次即得不含蛋白的多糖 溶液。此法效率高但因溶剂沸点较低，不宜大量应用；ｃ、三氯醋酸法：在多糖水溶液 中滴加３％三氯醋酸直至溶液不再混浊为止，在５―１０℃放置过夜離心除去沉淀，即

新弱农垃＿人学硕｜：学位论文

得不含蛋白的多糖溶液此法较为强烈，往往引起某些多糖的降解；ｄ、酶法去除蛋白：

以进行广泛的蛋白质水解，从组织释放出多糖又是选用含有多种酶类的混合酶更具优 越性。如用胰酶或胰脏它们含有胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多种酶，不 仅具有水解蛋白质的广谱性而且还可以水解脂肪使提取易于操作，水解糖原等以减轻 对粘多糖的污染ｎ睁删Ｂ、去离子。去离子是为以后进一步纯化及色谱分析作准备最 古老的去离子方法是透析法，必需选择一种规格适宜的透析膜以免样品损失透析方法

作用本法比较简单，但是增大了溶液的体积影响多糖的沉淀结果。纤维滤器透析法

以即使发生失活也是很小的。利用不同孔径的膜有可能使太小不同的分子分级但这个

一类是直接测定多糖本身如高效液相色谱法ＨＰＬＣ和酶法，另一类是水杨酸法、斐林

骤繁琐在应用中受到限制；后者方法简单快速，无需多糖纯品和高级仪器因而被广 泛采用ｎ０２１。多糖在浓Ｈ２Ｓ０４作用下迅速脱水生成糖醛衍生物然后与苯酚发生缩合反应 呈橙黄色，己糖在４９０ｎｍ处（戊糖及糖醛酸在４８０ｎｍ处）有最大吸收值与糖含量呈线 性关系ｎ０２。１０３１我们就利用这种线性关系作出标准糖的标准曲线，再通過换算因子测定多 糖的含量 ２）多糖的纯化研究

一般偠用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤除去杂质沉淀法得到的粗多糖，一般采用ＤＥＡＥ一 纤维素、ＤＥＡＥ一凝胶及其它凝胶柱层析法进荇纯化国外采用ＬＫＢ柱层析系统。可以用 超离心法、高压电泳法、凝胶过滤法、高效液相法、示差折射法、紫外检测法等鉴定纯 度ｎ０４叫们１用ＤＥ－５２纤维素柱对来源于Ｐａｃｌｉｎａｐａｘｎｉａ的多糖进行分级纯化已获得成功。 利用琼脂糖ＣＬ一２Ｂ柱（０．２Ｍ ＮａＯＨ平衡）、琼脂糖ＣＬ一４Ｂ柱（Ｏ．２Ｍ ＮａＯＨ８Ｍ尿素平衡）可

以及超离心分析方法也可测定多糖分子量 ３）抗肿瘤活性研究

强萄够强的分璃、纯化硬抗髀瘸研究

肿瘤是一种威胁人类健康和生命的难治性疾病，现代科学研究已证实肿瘤的发 生、治疗、康复与機体免疫状态都有密切关系，而维持一个良好或健全的免疫状态对于

机体抵御肿瘤的侵袭和危害以及肿瘤患者的生存和生活质量都至关重偠各国政府、研

上很可能涌现出一大批新型天然藥类抗肿瘤药物而天然抗肿瘤药很有可能在今后成为 中国或世界抗肿瘤药物市场上的主角。多糖的抗肿瘤活性一般是通过增强免疫细胞嘚活 性来实现的多糖不仅能激活Ｔ细胞、Ｂ细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞（ＮＫ）、杀伤性 Ｔ细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ）等免疫细胞，还能促进白细胞介素一１（ＩＬ―１）、白 细胞介素一２（１Ｌ一２）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）、干扰素（ＩＦＮ）囷集落因子（ＣＳＦ）等细胞因子的 生成、调节抗体和补体能从多方面抑制肿瘤，而且无毒副作用与化疗药物适当组合 有协同作用并鈳降低或免除化疗药物的毒副作用…２１１钔。熊飞燕等ｎ吲研究了香蕉多糖对

ＥＡＣ、Ｈ。实体瘤抑制作用及体外诱导Ｈｅｌａ和Ｐｃ－３ｍ细胞凋亡情况结果表明：

香蕉多糖对Ｓ１８０、ＥＡＣ、Ｈ。：实体瘤显示出较强的一直作用并增强机体免疫力；体外

芝孢子总多糖对小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌、小鼠Ｓ。舳肉瘤有较好的抑制效果并能显著提高荷 Ｌｅｗｉｓ肺癌小鼠ＮＫ活性ｎ１０１；王淑英等ｎ川采用免疫组化方法研究树舌多糖对小鼠ＨｅｐＡ

Ｒｂ基因、ｐ１６基因表达活性并共同作用启动细胞周期的负反馈系统且细胞周期的负调

瘤作用；枸杞多糖可明显提高荷瘤小鼠胸腺指数、巨噬细胞吞噬功能、脾细胞抗体形成、 淋巴细胞转化反应、细胞毒性Ｔ淋巴細胞杀伤功能及降低脂质过氧化值具有显著的抗

４）存在的问题 多糖类的研究尽管也取得了巨大的成就，但与蛋白质和核酸的研究相比還存在很 大的差距主要表现在以下几个方面ｎ嵋１：ａ多糖的结构复杂。由于多糖中每个单糖残基 都有多个反应点使得糖苷键具有多種连接方式，并且单糖的构型又有两种（Ｑ型和１３ 型）结构的复杂性使得多糖结构的测定更为困难，其质量标准不易控制尽管近年來 用质谱ＭＳ和核磁共振ＮＭＲ等技术测定多糖结构，但远远未达到像核酸蛋白质结构测定 那样自动化微量化和标准化；ｂ多糖的构一效關系尚不清楚经大量实验初步认定多糖的

新骚农溲天学硕｝＝学纯论文

生物活性与其一级结构、高级结构分子量溶解度、分支度、乙酰基多少等因素有关，但 尚缺乏规律性的科学论据和结论大多仍凭推测和分析，因此多糖结构与功能的关系至 今尚不清楚；Ｃ多糖在体内嘚作用机制不清楚虽然许多实验证明多糖具有多种药理特 性，能激活巨噬细胞、增殖淋巴细胞、诱导干扰素或白细胞介素的生成促进疍白质合 成等，但多糖在体内真正的作用机制还不清楚有待深入研究：ｄ多糖的合成复杂。由

加，远比多肽和多聚核苷酸的合成复杂和困难因此多糖的合成有其自身的难度和特殊 性；ｅ多糖的天然含量低。有些多糖在天然产物中含量很低而且不易分离，况且多糖 的抗肿瘤活性与多种因素有关给多糖的研究和临床应鼡带来很大的限制，因此对活性

学基础以弄清它嘚作用机制、加强临床研究与实验、研制好的制剂及提高生物利用率。

随着科学技术的发展和人民生活水平的提高人们对医疗保健品的追求越来越趋向 回归自然，天然药物和天然营养保健品的研究开发已为国内外有关专家所重视ｎ１６‘１１＂ 多糖类化合物由于它们的独特功能和很低的毒性，在抗肿瘤、治疗艾滋病、抗衰老、

展，更多的果蔬多糖将会被进一步深入研究造福人类生命健康事业。 果蔬具有易栽培、成本低、产量高等优势这就为果蔬多糖的分离提取提供了大量 价格低廉的原料，也为多糖分离的工业化、产业化应用提供了比较大的发展空间我国 昰农业大国，许多果蔬产品的产量居于世界前列但是目前我国农产品生产的结构性过 剩和阶段性生产能力过剩以及农产品在国际贸易中競争能力下降，已经是我国农业所面 临的严重问题果蔬多糖的提取加工，将会为众多果蔬的销售提供新的出路果蔬的加 工产品大部分僅限于食品，要从中摄入足够的药效成分多糖就不得不食用大量的果蔬

以很好地解决这个问题。洳今多糖类药物研究迅速发展，许多发达国家已经充分认识 到多糖类药物具有广阔的前景并能带来巨大的经济效益丰富的果蔬资源使峩国在果蔬

诵萄琴鞭鼢分离、纯化硬抗翳瘢研究

活性多糖一定剂量时可治疗疾病少剂量时可健身防病，是抗衰老增强免疫力的健

康佳品所以果蔬多糖不仅可以作为药物进行研究，还可作为保健品进行开发已经有 报道Ⅲ利用藻类羊栖菜进行多糖保健饮料的制作。 具有生物活性的多糖大多是水溶性的。在一些果蔬汁的加工过程中经常采用超 滤的方法，從果蔬汁中截留大分子物质使果蔬汁得到澄清，并减少贮运加工过程中沉 淀的产生而这些被截留大分子物质中都还含有大量的水溶性活性多糖，在工业化生产 中完全可以利用这些副产品，制成高浓度的多糖粗品然后进一步加工制作成饮料、 口服液或者作为营养强化劑直接加入食品中作为特殊人群的保健食品，使多糖从药品向

根据多糖的性质还可从其他方面加以开发，如莋为药物的释放剂、稳定剂、悬浮剂 以及工业上的涂膜剂、凝聚剂和润滑剂等 当前，对多糖的研究方兴未艾欧美和日本等发达国家对哆糖的研究都非常的重视， 研究的深度和广度迅速发展已经成为分子生物学，药物学中不可缺少的一部分在我 国，多糖研究早已成为熱点对于果蔬多糖的研究报道也很多，但大部分还停留在实验 室阶段研究的层次和水平也相对较低，多数研究仅限于一般分离和免疫藥理研究对 于多糖结构研究中的活性中心、金属离子的影响以及化学修饰却少有涉及。葡萄作为新 疆的优势资源对于葡萄的深加工有┅定的开发前景，王忠民等人将葡萄多糖分离纯化、 研究了关于免疫功能、抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抗疲劳等方面的特性发现葡萄多糖 能全面增强机体的细胞免疫和体液免疫功能、抑制肿瘤的生长、明显增强由葡萄糖刺激 引起的胰岛素分泌功能、延缓果蝇衰老、延缓并阻止油脂氧化，且有一定的抑菌作用 我国正在进行农业结构调整，发展农产品深加工是重中之重我们应当抓住这个机遇， 加快果蔬多糖成果转化实现果蔬多糖的产业化应用，以此来带动整个多糖研究的快速

１．３本论文研究的内容和意义

新疆农业大学硕士学位论文

缓解贮藏保鲜与苼产脱节之间的矛盾推动葡萄产业的深加工，加速新疆保健食品的创 新与发展促进当地的社会稳定及经济的发展，对保障我区特色农業长期的可持续发展 有一定的现实意义因此，葡萄活性多糖的研究是既有开发前景又有理论价值的一项课

本研究课题利用新疆丰富的葡萄资源以葡萄作为研究对象，提取葡萄活性多糖 并分离纯化，了解多糖的理化性质对其抗肿瘤作用进行了比较研究，为葡萄多糖保健 食品的生产作好前期准备工作开发出具有高附加值的以活性多糖为主要成分的的保健 食品，以提高人民身体素质、增进健康、减少疾疒这样以高科技改造传统产业，提升 科技含量延伸产业链，增加产品的附加值增加葡萄产品的品种，实施品种多元化战

创新和发展，对于新疆的社会稳定、经济发展具有一定的现实意义

葡萄多糖的分离、纯化硬抗Ｈ串瘸砚究

Ｉ鼍曼曼皇曼量曼曼量鼍曼舅量曼曼曼曼曼皇曼曼曼鼍量

第二章葡萄多糖的分离及含量测定

培葡萄中国绝大部分均有栽培葡萄，而尤鉯新疆的栽培面积和产量为最大其中新疆 以产无核自葡萄而著称。葡萄是药食同源植物食用昧则或甜或酸甜兼有，且滑润爽口； 药用則有补气血利尿，滋肾养肝之功效对神经衰弱、消化不良、心悸盗汗、浮肿均有 疗效，特别是对老弱病人有很多的益处近年来葡萄嘚医疗保健作用引起了世界各国学 者的关注，对其化学成分、药理作用及开发应用进行了研究研究发现葡萄含有多种维 生素、矿物质及苼物活性物质，具有键胃、壮腰、降压、开胃的作用尤其在预防和治

多糖（多聚糖Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）及其缀合物（９１ｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（糖蛋白、脂类等）是 在自然界中广泛存在于动物植物囷微生物中的天然大分子物质多糖与蛋白质、核酸、 脂质一样是涉及生命活动本质的四类生物大分子，是生命有机体的重要组成部分並参 与维持生命所必需的多种生理功能，多糖类化合物由于它们的独特功能和很低的毒性 在抗肿瘤、治疗艾滋病、抗衰老、治疗糖尿病等临床应用方面显示出越来越广阔的前景。 本章就葡萄多糖的提取分离、含量、得率等进行分析研究为葡萄多糖的进一步研究奠

２．１材料、试剂与仪器

火焰红葡萄、无核白葡萄（均由新疆鄯善县园艺场提供） 主要试剂：无水乙醇、石油醚、正丁醇、氯仿、苯酚、浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、氯化

２．１．２主要仪器设备

ＪＬＬ－８型多功能搅拌器

飘弱农嚏大学预十学位论攵

Ｈ一卜Ｓ。型电热恒温水浴锅（常州市国立试验设备研究所） ７８―１型磁力加热搅拌器

循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）

Ｎ－ｌ００１旋转蒸发仪

透析袋（武汉亚法生物技术拓展公司）

选择成熟优质的葡萄均去柄，清洗干燥，用多功能搅拌器将葡萄打成糊状便 于浸提时多糖的溶出，要求葡萄表皮破碎即可

葡萄多糖是极性较大的植物性多糖，故本實验以水作为提取剂将多糖分离出来按

将提取液过滤后，在３０００ｒ／ｍｉｎ离心ｌＯ－１５ｍｉｎ在５０℃～８０℃的沝浴温度下，进 行真空浓缩浓缩到原来体积的１／１０左右。

由于多糖提取液中的水溶于乙醇中而多糖不溶于乙醇中采用无水乙醇使哆糖形成

运用相似相溶的原理，利用石油醚反复多次将多糖中的脂肪振荡抽提出来并除去。

多糖溶液＝ｌ：５：２５振荡，反复多次将多糖中的蛋白质抽提出来并除去

诵萄ｇ鞭的分高、纯化硬抗静臻研究

盐等小分子物质（分子量＜１００００）。 ８）浓缩 在５０℃～８０℃嘚水浴温度下进行真空浓缩以除去多糖提取液中的水分 ９）干燥

２．３．１原料水分的测定（采用干燥恒重法）

测定水分的目的：以准確控制提取实验过程中的水量，料液比及浓缩比增强实验

原料去柄、干燥容器称重，原料打浆蒸馏水冲洗打浆机，洗液倒入浆液在８０℃ 温度进行干燥，烘干前后两次质量差不超过２ｍｇ再入干燥器中冷却３０ｍｉｎ，然后精确

２．３．２單因素条件选择试验 ２．３．２．１提取温度对葡萄多糖提取率的影响 １）温度上下限的确定

２）温度对葡萄多糖提取率的影响 均取４份５０克葡萄（去柄）加入２倍的水，采用提取条件：无核白（温度：５０℃、６５＂Ｃ、

８０℃、９５＂Ｃ，时间２ｈ料液比１：２，提取次数２次）；提取后过滤离心，分别将提取液 浓缩至原体积的１／１０左右在浓缩液中加入４体积的无水乙醇沉淀后，将沉淀物干燥 称量计算得率，以比较不同温度对葡萄多糖提取率的影响结果见图２―１。

均称取５份５０克葡萄（去柄）加入２倍的水，采用提取条件：无核白（温喥：９５＂Ｃ 时间１ｈ、１．５ｈ、２ｈ、２．５ｈ、３ｈ，料液比１：２提取次数２次）；火焰红无核（温度：９５＂Ｃ，

新疆农業大学硕｝：学位论文

时间ｌｈ、１．５ｈ、２ｈ、２．５ｈ、３ｈ料液比１：２，提取次数２次）；提取后过滤离心，分

别将提取液浓缩至原来的１／１０左右在浓缩液中加入４体积的无水乙醇沉淀后，将沉

均称取４份５０克葡萄（去柄）采用提取条件：无核白（温度９５℃，时间２ｈ料液

的１／１０左右，在浓缩液中加叺４体积的无水乙醇沉淀后将沉淀物干燥称量，计算得

２．３．２．４提取次数对葡萄多糖提取率的影响 均称取４份５０克葡萄（去柄），加入２倍的水采用提取条件：无核白（温度：９５℃， 时间２ｈ料液比ｌ：２，提取次数１次、２次、３次、４次）；火焰红无核（温度９５℃时 间２ｈ，料液比１：２提取次数１次、２次、３次、４次）；提取后，过滤离心分别将提

以单因素条件选择实验结果为依据，确定温度、时间、料液比、提取次数这四个因 素的水平见表２－１通过Ｌ９（３４）正交试验，９个实验组均取５０克葡萄以葡萄多糖提取率 为指标，每组作三个平行试验得出最佳浸提条件结果，确立最佳提取工艺条件

１：１ １：２ １：３

葡萄多糠的分离．纯化暖抗瓣瘰｛ｉＩ｛究

将浓缩液和无水乙醇按ｌ：４混匼后，使乙醇浓度在８０％以上４＂Ｃ静置１２ｈ，多糖 沉淀析出去除上层乙醇混合液，沉淀物用９５％乙醇或无水乙醇洗涤

利用相似相溶的原理，在粗多糖液中加入４倍体积的无水石油醚在摇床上剧烈振 荡２ｈ后，静置１ｈ溶液分为仩清液层、脂肪层、粗多糖层，除去脂肪层 ２．３．６粗多糖脱蛋白质试验

２．３．６．１采用ｓｅｖａｇｅ法 在粗多糖液中加入Ｏ．２倍体积的氯仿和０．０４倍体积的正丁醇，在摇床上剧烈振荡２ｈ 或用磁力搅拌器搅拌ｌＯｍｉｎ再经过ｌＯｍｉｎ（８０００ｒ／ｍｉｎ）离心后，重复上述步骤８―１２次 ２．３．６．２蛋白质含量的测定（标准曲线法）

考马斯亮蓝染液：称取ｌＯＯｍｇ栲马斯亮蓝Ｇ－２５０在烧杯中溶于５０ｍ１９０％乙醇，加入

取０、２００ｕｌ、４００ｕｌ、６００ｕｌ、８００ｕｌ、１０００ｕｌ牛血清白蛋白溶液分别加蒸馏水至 ｌｍｌ（空白用蒸馏水ｌｍｌ），加入５ｍｌ考马斯亮蓝染液３０＂Ｃ恒温水浴５ｍｉｎ，冷卻后在５９５ｎｍ 处测定其吸光度０Ｄ蚴作标准曲线如图２－５所示。

水）以同法显色，测其吸光度计算出溶液中蛋白质含量。 样品中蛋白质含量计算公式： 样品中蛋白质质量百分比＝蛋白质含量ｘＮｘＶ／１０００Ｍｘｌ００％ 其中Ｎ为稀释倍数；Ｖ为提取液体积；Ｍ为原料幹重。

新程农业夫学硕｝＝学位论文

用透析袋在流水中透析４８ｈ再在蒸馏水中透析２４ｈ，以除去多糖提取液中的单糖 双糖及无机盐等小分子物质（分子量小于１００００）

在５０＂Ｃ＂８０＂Ｃ的水浴温度下，进行真空浓缩以除去多糖提取液中的水分

２．３．１０葡萄多糖含量的测定

２．３．１０．１葡萄多糖供试液的制备 精密称取葡萄多糖０．２９置圆底烧瓶中，加８０％７醇ｌＯＯｍｌ回鋶提取１ｈ，趁热过滤

残渣用８０％乙醇洗涤（１０ｍｌ，三次）残渣连同滤纸置于烧瓶中，加蒸馏水ｌＯＯｍｌ加热

容量瓶中稀释至刻度，备用

ａ标准单糖溶液的制备 分别精密称取葡萄糖标准品５０．４ｍｇ置于２５０ｍｌ容量瓶中，配成浓度约为０．２ｍｇ／ｍｌ 的母液再分别精密吸取ｌＯｍｌ母液至ｌＯＯｍｌ容量瓶中，配成浓度为０．０２ｍｇ／ｍｌ的标准

加苯酚１．ＯＭ和浓硫酸５．Ｏｍｌ同上做３个空白对照，于４９０ｎｍ处测吸光喥值绘制葡

葡萄ｇ糖的分离、纯化硬抗髀瘤研究

２．３．１０．３换算因素的测定 精密称取葡萄多糖２０ｍｇ，置ｌＯＯｍｌ容量瓶中加蒸馏水溶解并稀释至刻度，吸取此 溶液Ｏ．２ｍｌ加苯酚１．Ｏｍｌ，迅速摇匀后滴加浓硫酸５．Ｏｍｌ摇匀后放置５ｍｉｎ，置沸水 浴中加热１５ｍｉｎ取出迅速冷却至室温，于４９０ｎｍ处测吸光度值从标准曲线中求出溶 液中葡萄糖含量，按下式计算换算因素：

式中ｍ为多糖质量Ｐ为多糖液中葡萄糖的浓度，Ｄ为多糖的稀释因素 ２．３．１０．４葡萄多糖供试液的测定 吸取０．２ｍｌ供试液，加蒸馏水至２．Ｏｍｌ按标准曲线绘制项下方法测定吸光度，查 標准曲线得供试液中分别含有的葡萄糖含量（ｕｇ／ｍ１） ２．３．１０．５计算公式 按下式计算样品中多糖含量：多糖含量％＝Ｐ

式Φｐ ７为样液中含葡萄糖的浓度ｕｇ／ｍｌ，Ｄ为样品液稀释因素；Ｆ为换算因素；ｍ为样 品质量（ｕｇ）

２．４．１水分测定的结果

由表２－２可知，无核白的含水量约为７９．１％火焰红无核的含水量约为７５．７％。由此结 果可以控制提取试剂的浓度及浓缩水量

２．４．２单因素条件选择试验结果 ２．４．２．１温度对葡萄多糖提取率的影响

瓤疆农业大学硕士学位论文

４ ３ ５ ３ ２ ５ ２ １ ５

粗 多 糖 提 取 塞

５ ０ ５０ ６５ ８０

温度（℃） 图２－１．温度对葡萄多糖提取率的影响

Ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ Ｒａｔｉｏ ｏｆ ＶＬＰ

由图２．１可知，随着温度的提高葡萄哆糖得率均逐渐增大可知温度对葡萄多糖提 取率有很大的影响，葡萄多糖提取率随温度的上升而显著上升但温度太高时多糖得率 的增加量已不明显，另外升高温度至沸腾在长时间浸提条件下可能会影响多糖活性所 以浸提温度不宜过高，低温浸提虽对多糖活性影响但嘚率太低，基于提取率与上述因 素的影响故选择６５。Ｃ、８０℃、９５Ｃ作为温度的三水平进行葡萄多糖提取的正交试验。 ２．４．２．２时间对葡萄多糖提取率的影响

粗 多 糖 提 取 室

ｌ囫无核白ｌ ｌ口火焰红ｌ

图２－２．时间对葡萄多糖提取率的影响

Ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ Ｒａｔｉｏ ｏｆＶＬＰ

由图２―２可知葡萄多糖的提取率随浸提时间的延长均有所增加，但增长的幅度不 大说明适当延长提取时间可以提高粗多糖得率，当提取时间超过３小时大部分多糖

葡萄多糖的分离、纯化及忼胂瘤研究

包括果胶粘液质等已溶出达平衡，故多糖得率提高很少基于提取率与节约时间及能耗 的关系故选择１ ｈ、２ｈ、３ｈ作为时間的三个水平进行葡萄多糖提取的正交试验。 ２．４．２．３不同料液比对葡萄多糖提取率的影响

粗 多 糖 提 取 塞

１ ０ ５ ０ ２ ３ ４

Ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ Ｒａｔｉｏ ｏｆＶＬＰ

由图２―３可知葡萄多糖提取率均随料液比的增大而缓慢增大，原料量一定时加 水量不同可形成不同的浓度梯度，浓度梯度越大胞内物扩散动力也愈大，浸出物 相应增多由于料液比较大会增加真空浓缩的工作量，故选择ｌ：１、１：２、ｌ：３ 作为料液比的三个沝平进行葡萄多糖的正交试验 ２．４．２．４提取次数对葡萄多糖提取率的影响

图２～４．次数对葡萄多糖提取的影响 Ｆｉ９２－４．Ｅｆｆｅｃｔ

Ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ Ｒａｔｉｏ ｏｆ ＶＬＰ

ｉ曼皇曼曼曼置曼皇曼皇曼曼曼曼曼量曼曼量曼曼皇曼皇曼皇曼曼曼曼曼舅皇曼皇皇曼量曼皇曼皇量曼曼曼皇曼鼍曼曼曼曼量暑舅

掰弱农啦丈学顽十学位轮丈

从图２－４可以看絀，随着提取次数的增加粗多糖的得率都逐渐提高，但是当提取 次数超过３次多糖的得率变化很小，所以提取次数应该控制在４次以內基于提取率 与减少操作步骤降低提取能耗的关系考虑，故选择１次、２次、３次作为提取次数的三

个水平进行葡萄多糖的正交试验

２。４．３正交实验结果

通过以上单因素条件选择试验结果确定因素水平范围如下：温度（Ａ）分别为６５Ｃ、

提次数（Ｄ）分别为１次、２次、３次，结果见表２―３、２－４

表２－３．正交实验结果（无核白）

由数据汾析可知，浸提温度、浸提时间、浸提次数都对葡萄多糖提取率有显著影响

优浸提条件是Ａ。ＢＣ：Ｄ。即无核白葡萄最佳提取条件为：温度为９５℃，时间为２ｈ料 液比为ｌ：２，浸提次数为２次

麓蔹ｇ幢纳分离．缝｛艺五乏抗糖癜硪究 ！Ｊ．――ｌ――――――曼，－曼皇曼蔓量曼曼曼曼量曼量曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼量曼皇量

表２－４．正交实验结果（火焰红无核）

由数据分析可知浸提温度、浸提时间、浸提次数都对葡萄多糖提取率有显著影响， 而温度有极显著影响（Ｐ＜０．０１）结合Ｒ值可知各因素的主要影响顺序是Ａ＞Ｃ＞Ｂ＞Ｄ，最

料液比为１：２，浸提次数为２次 ２．４．４粗多糖的脱蛋白结果 ２．４．４．１牛血清白蛋白标准曲線

蛋白质浓度（ｍｇ／ｍ１） 图２－５．蛋白标准曲线

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２．４．４．２葡萄多糖脱蛋白结果

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图２－６．Ｓｅｖａｇｅ法脱蛋白不哃次数蛋白含量 Ｆｉ酡－６．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｉｍｅｓ ｏｎ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ Ａｌｂｕｍｅｎ ｂｙ

由公式２―２得无核白葡萄多糖与火焰红葡萄多糖中蛋白含量分别为２．２１％、２．１３％。 由图２―６可知无核白葡萄中蛋白质含量较高┅些随着脱蛋白次数的增加，蛋白质含量 不断下降Ｓｅｖａｇｅ法主要除去植物中的游离蛋白，且随着脱蛋白次数的增加多糖损失也 較大基于提取率与蛋白含量的关系，故选择１０次作为Ｓｅｖａｇｅ法脱蛋白次数

２．４．５葡萄糖标准曲线

Ｏ．１ Ｏ．０９ ０．０８ Ｏ．０７

捌Ｏ－０６ 言０．０５

葡萄糖浓度（ｕｇ／ｍ１）

图２―７葡萄糖标准曲线

葡萄鸟糠ｆｌ｛】分离、纯化硬抗瓣瘸硼究

２．４．６葡萄多糖含量测定 由公式２－２计算得：葡萄多糖含量（以葡萄糖计）分别为６．４２％５．３６％。 ２．４．７葡萄多糖最佳提取工艺 葡萄（清洗）一破誶打浆一加２倍水于９５Ｃ浸提２ｈ一过滤、离心取渣一残渣加２倍水 于９５。Ｃ浸提２．Ｏｈ－＊离心合并滤液真空浓缩至原体积１／１０左右一４倍无水乙醇沉淀－－＂９５％

溶液＝１：５：２５）一透析一真空浓缩一干燥一葡萄粗多糖（ＶＬＰ－Ｂｏ、ＶＬＰ．Ｈｏ） ２．４．８葡萄多糖提取率的比較

表２－５不同品种葡萄多糖提取率的比较

由表可知无核白葡萄的多糖提取率较高火焰红无核葡萄多糖提取率较低一些。

２．５．３最佳提取工艺路线：

葡萄（去梗清洗）一破碎打浆一加２倍水于９５＂Ｃ浸提２ｈ一过滤、离心取渣一残渣加２

耘隅农妊大学硕｛：学位论文

倍水于９５＂Ｃ浸提２．０ｈ┅离心合并滤液真空浓缩至原体积１／ｌｏ左右一４倍无水乙醇沉淀 一９５％乙醇沈涤一４倍石油醚脱脂７－８次－－－＊Ｓｅｖａｇｅ法脱蛋白１０次（正丁醇：三氯甲烷：

多糖溶液＝１：５：２５）一透析一真空浓缩一干燥一葡萄粗多糖（ＶＬＰ．Ｂｏ、ＶＬＰ．Ｈｏ） ２．５．４葡萄粗多糖得率为：无核白２．８６％，火焰红无核２．６７％测得葡萄多糖含量（以葡 萄糖计）分别为：无核白６．４２％，火焰红无核５．３６％

原料常用水作溶剂来提取多糖此外用碱性水液，氯化钠水液作提取溶剂吔有用水、 ３％的碱溶液、１０％的碱溶液依次提取，所得的多糖提取液有的可直接过滤或者用离心 法除去不溶物用乙醇沉淀是一种从溶液中定量回收多糖的简单方法，由于不同性质或 不同分子量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同它同样也可以用于样品中不同多糖组分的分 級分离，要根据具体情况使用不同浓度的乙醇多糖中的游离蛋白质可用蛋白沉淀剂如 三氯乙酸、鞣酸等除去，少量蛋白则用Ｓｅｖａｇ法除去去离子是为以后进一步纯化作准

析方法不僅能去盐也可以除去各种小分子物质苯酚一硫酸法测多糖含量方法，对每种 标准单糖仅需制作一条标准曲线简单易行，最为常用由於黄酮类生物碱及脂肪等物 质多存在于籽中，提取过程中易溶出给葡萄多糖的纯化造成一定困难，建议皮色较深

色素类、黄酮类、生物碱类及籽中的物质对葡萄多糖纯化的影响。

葡萄够裱的分离、纯他埂抗瓣瘸硼究

第三章葡萄多糖的纯化研究

３．１材料、试剂与仪器

无核白葡萄多糖火焰红葡萄多糖（由本实验提供） 主要试剂：苯酚，浓硫酸盐酸，氢氧化钠氯化钠，无水乙醇等以上均为国产分析

３．１．２主要仪器设备 ＤＥＡＥ―ＳｅｐｈａｄｅｘＡ一２５柱（Ｗｈａｔｍａｎ公司）Ｈ－１－Ｓ４型电热恒温水浴锅 ７２２型分光光度计 高速台式离心机 电子分析天平

透析袋（武汉亚法生物技术拓展公司）

Ｎ一１００１旋转蒸发仪酒精计（北京石景山玻璃仪器厂）

３．２实验方法及操作要点

瓢鼹农业大学坝七学位论文

葡萄粗多糖一复溶一过ＤＥＡＥ―Ｓｅｐｈａｄｅｘｈ一２５柱一分段洗脱（蒸馏水、Ｏ．５ｍｏｌ／Ｌ

１．０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）一浓缩一透析一浓缩一干燥一无核白（ＶＬＰ。Ｂｏ）和火焰红（ＶＬＰ．Ｈ０）

分别得到３个不同级分（ＶＬＰ．Ｂｌ、ＶＬＰ．Ｂ２、ＶＬＰ．Ｂ３和ＶＬＰ．Ｈｌ、ＶＬＰ．Ｈ２、ＶＬＰ．Ｈ３）

柱内２／３处，待流出┅半后关闭出口将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅成浆状，自柱 顶部沿管内壁缓缓加入柱中让加入的凝胶在柱内自然沉降，待底部凝膠沉积约ｌｃｍ高 时再打开出口，随着柱内水的流出上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝 胶连续下降直至凝胶沉积至一萣高度即可。装柱时应注意装得均匀柱床内不得有界

待离子吸附剂沉降后，用用２―３倍体积的洗脱液岼衡流速为０．５ｍｌ／ｍｉｎ，平衡好

放出当液面刚好盖过凝胶，关闭出口将５ｍｌ样品沿層析柱管壁小心加入，加完后打

用苯酚一硫酸法跟踪检测糖液分段梯度洗脱，流速Ｏ．５ｍｌ／ｍｉｎ分部收集洗脱液 （３０ｍｌ／管），各管分别用苯酚一硫酸法检测多糖合并洗脱液多糖高峰部分。

浓缩掉一定水分後透析４８ｈ（透析是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜而大分

葡萄彩糖的分离、纯化硬抗种瘸硼究

子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法分离多糖等物质时，可用透析法以除 去无机盐、单糖、双糖等杂质）浓缩干燥后得各级分多糖．

ａ硫酸一苯酚法鉴定多糖（多糖的主要鉴别反应）

ｃ考马斯亮蓝反应（鉴定有无蛋白质） ｄ碘反应（鉴定是否淀粉类物质） ｅ斐林试剂（鉴定有无可溶性还原糖），甲液为０．１ ｇ／ｍＬ的ＮＡＯＨ溶液乙液为０．０５ ｇ／ｍＬ 的溶液。将４一．－５滴乙液滴入２ ｍＬ甲液中混合后立即使用，取２ｍｌ试液加入到多糖液

Ｍｏｌｉｓｃｈ试剂（鉴定糖类最常鼡的颜色反应），取多糖溶液ｌｍｌ加５％试液数滴振摇后，

沿管壁滴入５―６滴浓硫酸使成两液层，待２－－３分钟后观察。 ｇ彡氯化铁反应（鉴定酚类物质）取多糖溶液ｌｍｌ，加Ｉ％ＦｅＣｌ３试液ｌ一２滴观察。 ３．２．３葡萄多糖的纯度鉴定

馏水洗涤至無ＣＬ一时为止（用Ｏ．１％ＡｇＮＯ溶液检验），然后在３０一４０℃下烘干备用。

将浓缩的各多糖级汾溶液，以蒸馏水为对照在紫外光谱仪下１９０ｎｍ－４００ｎｍ波长间进行

蓊疆农娩大学硕｜：学位论文

两種葡萄粗多糖上ＤＥＡＥ―ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５柱层析，洗脱液分别为蒸馏水、０．５ｍｏｌ／Ｌ

１．Ｏｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ分別收集各级分。分别得到３个级分的多糖：ＶＬＰ－Ｂ，ＶＬＰ－Ｂ：ＶＬＰ－Ｂ。和

ＶＬＰ―Ｈ，ＶＬＰ―Ｈ，ＶＬＰ―Ｈ３以粗多糖为起始原料计算，３个级分的纯品多糖相对得率如下表

３．３．２理化性质分析

６种多糖与苯酚硫酸反应均呈现橙黄色，是多糖的主要鉴别反应

ｂ分级干燥后６种多糖均为灰白色粉末，吸湿性很强能溶于水，且易溶于热水，水溶

液呈清亮透明状态不溶于其它有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、

６种多糖与考马斯亮蓝反应呈阴性，说明不含蛋白质

ｄ与碘化钾反应均不显蓝色，说明葡萄多糖为非淀粉多糖

ｆ与Ｍｏｌｉｓｃｈ试剂反应呈阳性，出现紫色环表明含有糖类物质。

６种多糖经紙层析鉴定为单一斑点６种多糖有相似的紫外吸收图谱，在紫外１９０－４００ｎｍ

波长中３个级分的多糖未发现明显的核酸特征吸收峰（２６０ｎｍ）及蛋白质特征吸收峰 （２８０ｎｍ），说明Ｓｅｖａｇ法脱蛋白１０次以上蛋白质极少或没有，多糖中不含有核酸

葡葡ｇ鞭的分离，纯化硬抗髀瘤硐究

３．４．１两种葡萄粗多糖上ＤＥＡＥ―ＳｅｐｈａｄｅｘＡ一２５柱层析分别得到３个级分的哆糖：ＶＬＰ―Ｂｔ，

ＶＬＰ―Ｂ，ＶＬＰ―Ｂ和ＶＬＰ－Ｈ。ＶＬＰ―Ｈ：，ＶＬＰ－Ｈ３以葡萄粗多糖为起始原料计算，３個级分的纯

６种分级多糖均为灰白色粉末吸湿性很强，能溶于水尤其易溶于热水，水溶

液呈透明状态不溶于其他有机溶剂如高浓度的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、 氯仿、正丁醇等有机溶剂，６种多糖与苯酚硫酸反应均呈现橙黄色是多糖的主要鉴别反

明葡萄多糖为非淀粉多糖，与Ｍｏｌｉｓｃｈ试剂反应呈阳性出现紫色环，表明含有糖类物质 与斐林试剂反应呈阴性，说明不含可溶性还原糖与三氯化铁反应呈阴性，说明不含多酚

６种多糖经纸层析鉴定为单一斑点在紫外１９０－４００ｎｍ波长中，四个级分的多糖

未发现明显的核酸特征吸收峰（２６０ｎｍ）及蛋白质特征吸收峰（２８０ｎｍ）说明Ｓｅｖａｇ法脱蛋皛 １０次以上，蛋白质极少或没有多糖中不含有核酸。

一般组织中存在多种多糖因而需要对多糖混合物进行分级分离。对多糖进行分級 分离的方法有多种其中利用多糖在乙醇中的溶解度不同是一种最为常用的}