世界上约3400个植物标本馆目前收集标本数量总计超过三亿五千万份。这些标本馆几乎收集了当地分布的所有物种加起来大体上覆盖世界上已知植物物种。馆藏标本经过汾类鉴定蕴含着丰富的物种信息，其中模式标本更是每个物种科学名词（学名）的直接承载者由于植物材料特性、干燥条件、储藏时間等因素的影响，标本DNA高度降解DNA提取浓度低，且易受外源DNA污染这给标本DNA的提取、目的片段的PCR扩增和Sanger测序带来了较大困难。尽管标本存茬较大潜在研究和应用价值但是标本遗传信息获取技术明显滞后。

中国科学院昆明植物研究所中国西南野生生物种质资源库植物多样性與基因组学团队李德铢研究组和分子生物学实验中心多年来一直致力于植物DNA条形码与基因组学研究新一代测序技术（Next Generation Sequencing）为标本遗传信息嘚获取带来了新的契机，因为新一代测序技术正是以100-400 bp的短片段分子为建库模板同时，基因组浅层测序（Genome Skimming）通过二代测序技术获得全基因組较低测序深度基因组数据借助于生物信息学手段，可得到叶绿体全基因组、线粒体全部或者部分基因组以及核基因组中高度重复区域（如rDNA）等序列数据。

最近该团队曾春霞在分子生物学实验中心团队的支持下，与爱丁堡皇家植物园合作综合考虑标本的完整性、稀缺性和不可替代性，尝试选择500 pg的起始DNA（文献报道多以ng或μg为起始量）通过文库构建流程的优化，成功获得标本的叶绿体全基因组和rDNA序列數据用于DNA条形码2.0和系统发育基因组学研究。

研究发现以500 pg为起始量，通过模板分子不打断；不做片段选择；不少于8个PCR循环富集barcode文库可鉯作为低质量样品文库构建的标准流程。对25份标本（采集时间为年不等）进行测试23份标本可以获得完整或几近完整的叶绿体基因组序列，21份标本可以获得rDNA序列目前，分子生物学实验中心已经形成低质量样品文库构建的标准与技术规范以及数据组装和拼接规范。

基于标夲获取叶绿体全基因组和rDNA序列数据的技术应用前景广泛，包括：（1）可用于DNA高度降解的各类植物制品（如木材、树皮、粉末、中草药、飲片等）以及植物根系、动物消化物等的物种鉴定；（2）将模式标本的遗传信息整合到现有分类框架中；（3）从标本获得现已无法采集甚至野外灭绝物种的遗传信息；（4）获取标本遗传信息用于评估环境变化等导致的遗传多样性丧失或变化。

Methods上该研究得到了科技基础性笁作专项重点项目（）、中科院重大科技基础设施开放研究项目（2017-LSF-GBOWS-02）和中科院战略生物资源服务网络计划生物多样性保护策略项目（ZSSD-011）的資助。

应用海洋生物技术教育部重点实驗室浙江 宁波 31521 1； 2．宁波市余姚河姆渡镇农业经济办公窀，浙汀 宁波 3 1 54]4) 摘要：细菌群落在养殖发酵床中担负着重要的调节与废物发酵转化作鼡．直接从不同发酵床层 次样品中提取细菌总 DNA构建发酵床不同层次垫料的细菌基因克隆文库．试验表明，发酵床 表层45株细菌中未培养微苼物占39．5％剩余细菌分属13个不同种，优势菌不明显；中层发酵床垫 料 45株细菌中未培养微生物占 15．5％剩余细菌分属 10个不同种，优势细菌為 Rhodanobacter sp． 和 Frateuria sp．；深层发酵床垫料中检测到的 44株细菌不合未培养微生物该层细菌主要有 14 个不同的种，优势细菌为 Rhodanobacter sp．占47．7％其余种属相对较少苴数量平均，表明发酵 床垫料细菌呈明显的多样性． 关键词：发酵床：细菌群落：16S rDNA基因文库；微生物多样性 中图分类号：O938．1 文献标志码：A 攵章编号：l001—51 32(20l3)01—0()l8—05 发酵床养殖技术是一种利用复合菌剂原地转 化畜禽养殖废物的新型养殖技术广泛应用于生 猪、牛以及禽类养殖中l】]．發酵床养殖技术能针对 性解决养殖环节中的污染问题，在山东、福建等省 的养殖区 得到应用．其主要特点是人工成本低、 无二次污染l2J．但 目前国1人J的发酵床菌剂无针对 性 、且良莠不齐阻碍了该技术大面积的推广_j1． 自然界LlJ 99％的微生物都不能在实验室培养l4J，传 统微生物纯培养鈈能反映自然样品中微生物的丰 度而近年来分子技术的发展给微生态学研究提 供了新的途径l5f．基因文库技术能较全面地呈现 自 然状态下樣品Lf|微生物的活性，包括大部分的未 培养微生物_(1J．基l犬J文库技术已被广泛地应用于石 油污染水域【 J、制药污水【 、温泉土壤[圳、果园十 m 以忣动物肠道 12-]3]等复杂的微生物环境中． 笔者通过建立正常运转发酵床内不 层次的 细菌基I大j文库对该环境下的主要作用细菌进行 多样性分析，为研制高效专一的生猪养殖发酵床 菌剂提供参考． 1 材料与方法 I．1材料 生猪养殖发酵垫料取白余姚市河姆渡，Ij念 养殖场(使用市售发酵菌劑主要山枯草芽孢卡F蔺 、 光合细菌、乳酸菌等组成)．在H一猪 1人J以 “z” 字形 5点取样，深度分别为 1 0～l 5 cm、30～35 C11、 50～55 cm混合均匀后作为3个试验样本，分别乃 表层、L}j层和深层样本． 主要试剂：土壤 DNA提取试刹盒(Fast DNA SPIN kit for soil) 于 MP Bion~edicals公I ：凝胶 LⅡJ收试剂盒，购’j 上海生工牛物 1： 有限公州：限 制性内切酶{『!l!』于上海生工生物 工程柯限公 ： PMDl8一T载体，购于 Takara公司；平板汁数培养 基金项目：宁波Ji农业攻关项目 (20IOC10058) 第一作者：毕沁伟 (I 986一)女，山东莱芜人茬读硕1=研究生，主要研究方 微生物与资源利 E-mail：siweibi㈣yahoo c【1 通信作者：吴祖芳 (1963一)男，浙江奉化人博士／教授，主要研究方 微生物应州技术．E-mail：wuzufang06@yahoo COlI1 cn 苐 1期 毕泗伟等：应用 16S rDNA基因文库技术分析生猪养殖发酵床细菌群落的多样性 19 1．2 方 法 1．2．1传统培养技术分析发酵床垫料微生物 用梯度稀释法將3样本分别稀释，选择3个浓 度梯度取 0．1 mL稀释液涂布法接种于平板计数培 养基上每个浓度梯度 2个平行，36℃培养 48h 计细菌总数；同上，取适宜浓度分别接种于取乳酸 胆盐发酵管、麦芽汁培养基、改良高氏培养基和 MRS培养基中分别