产油脂酵母菌株的筛选_百度文库
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产油脂酵母菌株的筛选
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你可能喜欢南阳理工学院毕业设计（论文）开题报告生物与化学工程 系 生物工程 专业课题名称：产油脂酵母资源化利用啤酒生产废水的研究学生姓名： 学 号：梁跃辉
郭书贤 教授 2013 年 1 月指导教师： 报告日期：1．本课题所涉
及的问题在国内（外）的研究现状综述（文献综述） 1．1 啤酒生产废水的特性及主要处理方法1.1.1 啤酒工业废水的来源 制造啤酒所需的原料主要是大麦和大米，辅之以啤酒花和鲜酵母。啤酒制造过程需要消耗大 量的新鲜水，相应地也会产生大量的高浓度有机废水，啤酒生产的所有工段几乎都会产生废水在 啤酒生产的整个工艺中，几乎每个工段都有以废水为主的废弃物排出。主要包括以下几种 1 ○冷却水，其属于清洁废水约占总水量的 70％； 2 ○酿造涮洗废水 (如麦芽制作、糖化、发酵)约 占总量的 5％一 6％，这部分水含有多少不一 的有机物和无机物，如废酵母、废硅藻土及洗涤剂等，属高浓度有机废水； 3 ○洗瓶、冲洗 、杀菌水约占总量的 20 ％，啤酒废水富含有机物和一定浓度的悬浮颗粒固体 (SS)，其中 COD 、BOD 质量浓度高达数千 mg／LSS 也达到数百 m r／L~引，另外还含有大量 的 N 、P 无机盐，这些废物本身并无毒 ，但含有大量可被生物降解的有机物质，若不加治理直 接外排，将导致地表水体的富营养化，并且直接污染地下水。鉴于啤酒废水可生化性强的特点， 选择处理工艺时优先考虑生化法，为提高水的利用程度和改善污泥脱水性，也常采用物化法，如 投加药剂等[1] 。 1.1.2 啤酒工业废水特性 啤酒工业废水主要含糖类、醇类、蛋白质、脂肪等有机物，有机物浓度较高，呈酸性，pH 值 为 4.5～6.5。啤酒废水的主要特点之一是 BOD5/CODCr 值高，一般在 50%及以上，非常有利于生 化处理。 啤酒工业废水有如下的特点和性质： (1)啤酒工业在生产啤酒过程中耗水量相当大，吨酒耗水量约为 10---30 吨，随着生产工艺、 生产水平和管理方式而异。 (2)废水来源复杂、多样。其来源有冷却水、清洗废水、冲渣废水、灌装废水、洗瓶洗缸废水、 清洁、生活废水[2]。 (3)废水中主要污染物成分是：糖类、醇类、氨基酸、果胶、啤酒花、维生素、蛋白化合物及 包装车间的有机物和少量无机盐类等。其 BOD5/COD 较高，为 0.4~0.6[3]，并有大量悬浮物，如麦 渣等，也常有在消毒清洁过程中投入的碱性清洗剂、杀菌剂。 (4)废水水量水质常依赖生产周期，水量水质波动很大。生产期废水量巨大，COD 较高，可达 数千，pH 值以微碱至中碱性为主；生产间歇期废水量少，以生活污水为主[4,5]，COD 仅几百，pH 值为微酸性。现代啤酒厂常年生产不存在间歇期。 1.1.3 啤酒工业废水在目前的主要处理方法 伴随着经济的高速发展，中国对啤酒废水的处理工艺和技术进行了大量的研究和探索。如今 已经形成了以生化为主，生化与物化相结合的处理工艺。由于啤酒废水中的 BOD5/CODcr 的值较 高，非常有利于生化处理，这类型的处理方法比普通的物化法、化学法具有在工艺上成熟、处理 效率高级成本低等优点[6]，目前，国内外普遍采用好氧生物处理和厌氧生物处理等生化方法来处 理啤酒废水。好氧生物处理主要有活性污泥法和生物膜法。活性污泥法在中、低浓度有机废水处 理中使用最多，这种方法处理过程可靠，而且通过较少的投资就能达到非常好的处理效果，优势 明显。我国大多数啤酒企业均采用这种方法来处理啤酒生产废水。生物膜法则是在处理池中加入 填料，利用附着生长于填料表面上的微生物来对废水进行处理，不会出现污泥膨胀的问题。生物 膜法主要有生物转盘法和生物接触氧化法，这些方法在啤酒废水处理中均被大量采用。 啤酒废水 中有机碳的含量很高，氮、磷的含量也有一定水平，可用于农田灌溉，同时经絮凝处理得到的沉 淀物可以考虑作为饲料或有机肥料。据报道，无锡市酿酒总厂在废水氧化池中种植丝瓜以强化系 统处理废水的净化效果[7]。-2-1.1.3.1 好氧生物处理 好氧生物处理是在氧气充足的条件下， 利用好氧微生物的生命活动氧化啤酒废水中的有机物， 其产物是二氧化碳、水及能量(释放于水中)。活性污泥法、生物膜法、深井曝气法是较有代表性 的好氧生物处理方法。 SBR ( Sequencing Batch Reactor，SBR )是活性污泥法的简称，我国近 10 多年来才开始对 SBR 生物废水处理进行研究。 湖南湘潭大学于 1989 年完成了应用 SBR 工艺处理啤酒废水的中试工作。 该工艺省去了二沉池、污泥回流设备，布置紧凑，节省土地而且又经过数年的完善，现在已开始 应用于实际生产中我国的珠江啤酒厂、广州啤酒厂、安徽圣泉啤酒厂、大田县啤酒厂、扬州啤酒 厂和长春啤酒厂等厂家均采用此法处理啤酒废水[7]。此法的优缺点：活性污泥法是中、低浓度有 机废水处理中使用最多、运行可靠的方法，具有投资省、处理效果好等优点 [8]。但是此法在用空 气曝气时容易产生泡沫，造成难以充氧，管理不好则易产生污泥膨胀，此外还因动力消耗高、占 地面积较大等缺点限制了其应用[9]。 曝气生物滤池法 (BA F 法)是 20 世纪 80 年代末在欧美发展起来的一种新型污水处理技术， 它 综合过滤、吸附和生物代谢等多种作用 ，使其具有占地少、出水水质好、对环境影响小，且不易 形成活性污泥膨胀等优点。曝气生物滤池中的粒状颗粒具有较大的比表面积，它一方面提供了微 生物生长的场所 ，另一方面还可以截留产生的污泥。该方法省去了二沉池，对 BOD 、COD 的 去除率可达到 70％以上。曝气生物滤池法的优点是：占地面积少，效能高，对氧的利用率大，无 恶臭产生等；深井曝气也有不足之处，如施工难度大，造价高，防渗漏技术不过关等[10]。 生物膜法中生物膜接触氧化法和生物转盘法是这类方法的代表， 在啤酒废水治理中均被采用， 主要是降低啤酒废水中的 BOD。生物接触氧化法在国内应用很广，其主要优点是处理能力大，无 污泥膨胀，运行管理方便等。国内采用生物接触氧化法处理啤酒废水的啤酒厂有青岛啤厂、抚顺 啤酒厂、 房山啤酒厂等。 废水 COD 为 mg/L， 处理后出水 COD 为 100mg/L， 去除率达 90％～ 92％。采用生物转盘的工厂有杭州啤酒厂、上海华光啤酒厂等，进水 COD 为 1500mg/L，处理后出 水 COD 为 30～150mg/L，去除率 90％～98％[11]。生物转盘法前期基建投资高，受气温变化影响大， 不适合于气温偏低的地区使用。因此生物转盘法处理啤酒废水主要用在我国南方的小型啤酒厂。 好氧生物处理还有氧化塘法和膜生物反应器(MBR)，其中 MBR 是 90 年代兴起的一种废水生化 处理的新技术，它是用膜组件替代传统二沉池进行固液分离的一种新型高效废水处理技术，与传 统的活性污泥法相比，膜生物反应器具有污染物去除效率高、出水水质稳定、装置容积负荷大、 设备占地面积小、传氧效率高、污泥产量低、操作运行简便等优点。其缺点就是膜清洗比较困难， 使得整个处理设施的运行费用较高。 1.1.3.2 厌氧生物处理 厌氧处理工艺形式多样 ，特点各异，但其基本原理都是利用厌氧水解菌和厌氧产甲烷菌的代 谢活动，将水中的大分子有机污染物水解为小分子的醇类和有机酸，最终转化为甲烷和二氧化碳。 20 世纪 70 年代以来，废水厌氧处理技术因其具有投资少，运行费用低及能产生能量等优点而得 到较快的发展和应用。 目前以上流式厌氧污泥床(UASB)为代表的第 2 代反应器和以厌氧颗粒污泥 膨胀床(EGSB )和厌氧内循环反应器(IC)为代表的反应器已被广泛引入到啤酒废水处理工程应用 中，并取得了良好的效果。目前在啤酒处理工艺上，厌氧工艺应用比较多的有 UASB 工艺、IC 工 艺和酸化水解工艺。 升流式厌氧污泥床(USAB)是 由荷兰 Wageninger 农业大学 Letting a 教授提出。 它利用厌氧微 生物降解废水中的有机物，具有效能高，处理费用低，电耗省，投资少，占地面积小等一系列优 点， 完全适用于高浓度啤酒废水的治理[12]国内已有北京啤酒厂、 沈阳啤酒厂等厂家利用 UASB 来处 理啤酒废水清华大学在常温条件下利用 UASB 厌氧处理啤酒废水的研究结果表明， 进水 COD 浓度为 [13] 2000mg/L 时，去除率为 85％～90％ 。 EGSB 综合了流化床(FB)和上流式厌氧污泥床 (UASB)的优点，主要依靠颗粒污泥来处理废-3-水，在当前属于较先进的厌氧法，优缺点：EGSB 受的影响较小，只要 Ss 的沉速小于反应器内的 上升流速(3―10 m／h)，Ss 就能通过污泥区得以去除，而 UASB 最大上升流速为 1 m／h，易受 Ss 的影响。完全封闭的系统保证了臭气不会散发出来，且可在一定的压力下工作，从而省去沼气 压缩设备。 1.1.3.3 厌氧+好氧处理方法处理啤酒废水 水解酸化+SBR 法是在传统的活性污泥的基础上，以水解酸化池代替初沉池水解酸化+SBR 法处 理高浓度啤酒废水效果比较理想，去除率均在 94％以上，最高达 99％以上。 内循环 UASB 技术是 在普通 UASB 技术的基础上增加一套内循环系统，它包括回流水池及回流水泵。UASB 反应器的出 水水质一般都比较稳定，在回流系统的作用下重新回到配水系统。这样一来能提高 UASB 反应器对 进水水温、 值和 COD 浓度的适应能力， pH 只需在 UASB 反应器进水前对其 pH 和温度进行粗调即可。 运行结果表明：COD 总去除率高达 95％以上。可根据啤酒生产的季节性、水质和水量的情况调整 UASB 反应器或氧化沟处理运行组合，以便进一步降低运行费用。厌氧+好氧处理的方法还有水解 酸化+生物接触氧化法，IC+CIRCOX 反应器法，UASB+SBR 组合工艺等。 1.1.4 啤酒生产过程的节水利用 啤酒生产耗水量大，相应就会排放废水，因此在生产过程中降低用水量减少少啤酒废水排放 的一种重要措施，同时充分利用达标排放的废水。这不仅实现了废水的资源化，而且在经济、环 境、社会效益上有积极作用。 资源节约与环境保护同步进行资源节约与环境保护同等重要， 在综合包装车间可将酒机抽真空 的水用于杀菌机，平均每吨酒的耗水量降为 1.64 吨；在动力车间，将反渗透装置排出的废水回收 用于透风机冷却以及污泥带式压滤机的冲洗，平均每吨酒的耗水量降约 0.3 吨[15]搞好资源节约变 废为宝，在一定程度上减少了环境污染。啤酒厂对啤酒生产中产生的酒渣全部作为饲料 ，一部分 卖给当地农民。一部分供给本厂的牲畜饲养场，不仅增加了企业收入，同是也降低了废水中的有 机物含量，减轻了后一步的废水处理负担。 啤酒厂将废水分为两部分，○对于水质较好无污染的水进行充分的回收利用，达到节约水资 1 源的目的；○制冷机 、空压机 、二氧化碳回收设备的间接冷却水，水质好，首先回收到一个地 2 下水池中，然后用于杀菌机 、人工洗瓶、职工洗澡等 ；○ 热麦汁冷却水先回收到钢制高压水箱 3 中，再作为糖化工序用水和发酵罐 、清酒罐冲洗用水；糖化间接加热设备的冷凝水经地下管道流 至锅炉房软化罐中，作为锅炉软化用水，这一回收工作不仅节约了水资源，节约了部分热量，而 且减少了环境污染； ○啤酒灌装真空泵循环水、水质好 、温度低，回收后作为啤酒杀菌机的最 4 后喷淋降温，减少了自来水的用量。通过采取以上水资源综台利用措施，每年可以多为企业和社 会创造数以亿计的财富[16]。-4-1.2 啤酒废水的微生物资源化利用现状 啤酒厂将废水分为两部分，对于水质较好无污染的水进行充分的回收利用，达到节约水资源 的目的[17]通过以上两方面的论述可知用酵母处理废水是一条重要的废水资源化利用和处理方法， 目前国内外有关啤酒废水资源化处理技术的研究主要集中于以下几个领域（1）利用啤酒废水生产 单细胞蛋白（2）利用啤酒废水生产微藻（3）利用啤酒废水制备生物絮凝剂（4）利用啤酒废水发 酵产生氢（5）用微生物燃料电池处理废水（6）利用啤酒废水在微生物作用下产生油脂[18]。 1.2.1 利用啤酒废水产生单细胞蛋白 我国 SCP 生产始于 1922 年, 但前期发展缓慢。80 年代以来, 发展迅速, 主要产品为酵母、饲 料酵母 (包括固体发酵产品, 亦称固体酵母)，但 目前，我国蛋白质饲科仍严重短缺，影响了畜牧 渔业的发展，为此每年不得不花费大量外汇进口鱼粉等． 利用发酵工业废水生产单细胞蛋白 （single-cell protein）是解决蛋白质饲科的一条重要途径，并且微生物利用 废水中的有机物质生 产单细胞 蛋 白，在回收菌体蛋白后 ．废水 中 C O D ．B O D 值明显下降了，有报导 C O D 可 下降 50 ～70％．为进 一步治理创造 了条件。单细胞蛋白是指利用各种机制大规模培养细菌酵 母菌、霉菌、微藻和担子菌所获得生物微生物蛋白，可作为动物饲料和人类食品[19]。目前 SCP 的 开发利用是各国研究的热点 ，但其产成本太高限制了其工业化应用。利用含有高浓度有机质的啤 酒废水培养微生物生 SCP，可在降低废水中有机物含量的同时得到利用价值高的饲料蛋白质。目 前用于生的 SC P 的菌种很多 ， 据报道利用啤酒废水为原料生产 SC P 的菌种主要有酵母菌 、 状 丝 真菌 、镰刀菌属 (Fusarium) 、木霉属(Trichoderma)等 。其中利用酵母菌处理啤酒废水生产单细 胞蛋白的研究比较广泛，但因成本高不易推广。丝状真菌同酵母菌相比，因大多数生长较慢 、蛋 白质含量较低 ，尚未引起重视。一些相关研究表明，利用啤酒废水培养微生物生产的 SCP 不仅 氨基酸俱全 ，而且大多数氨基酸含量接近饲用鱼粉和酵母水平 ，是一种优质的蛋白饲料 。如丰 慧根等报道利用两株优良的丝状真菌（Fusariu ITI Bf- 66 和 T ric hod rlTI lT h -27）可以直接利用 高浓度啤酒废水 中的有机物质生产 SCP ，不仅可大幅度降低废水中的 CO D 和 B OD 值 ，而 且所得 SCP 蛋 白质含量较高 ，并证明无毒 ，适于作动物饲料。 1.2.2.利用啤酒废水培养微藻 利用啤酒废水可快速培养 出可作为食品、饵料、药品原料的藻类，如螺旋藻（Spirulina )、 小球藻(Chlorella)等。螺旋藻蛋白质含量高，富含人类和动物所必需的氨基酸、脂肪酸等营养[20]。 如郑爱榕等利用曝气处理啤酒废水养殖极大螺旋藻，并将 CFTR I 培养基纯种培养与其作对照，其 相对生长率与 C FTR I 培养基的几乎一致 ，蛋白质含量第 6 天最高，为 0．2886g／g 干质量 ， 并确定曝气处理废水养藻最佳条件为用 NaOH 调废水 pH 为 7．0、藻初始密度取 53．8m g／L 、 光照在
lx 范同，添加尿素或碳酸氢钠或曝气 8h／d。经光合细菌(PSB )处理的啤酒废 水养殖螺旋藻，蛋白质为 0.4825g／g 干质量 ，与 CFTR I 培养基养殖的相近，废水与 PSB 的体 积比为 3：1。小球藻是高价值微藻，能有效地富集和降解多种有机化合物，如有机氯化合物、有 机氮化合物、金属有机化合物等。处理废水后的小藻体含丰富的蛋白质、矿物质、维生素、氨基 酸等营养成分，其营养价值可与鱼肉、大豆相比，可作为高蛋白动物饲料。如曲春波等利用啤酒 废水小球藻异养培养， 发现小球藻对啤酒废水与 Basal 培养基混合液的 C O D 、 D 、 BO 还原糖 、 氨态氮和硝态氮的去除率分别为 83．10％、81．17％、96．19％、70．16％和 86．17％，去除 率都比较高，小球藻对废水混合液的净化效果非常有效，营养物质利用率高。 1.2.3 利用啤酒废水制备微生物絮凝剂 微生物絮凝剂(M icrobiology flocculant，MBF)是利用生物技术，从微生物或其分泌物中提取、 纯化而获得的一种安全、高效、能自然降解的新型水处理剂，包括糖蛋白、多糖、纤维素 、蛋白 质和 D N A 等[21] 。微生物絮凝剂可克服无机高分子和合成有机高分子絮凝剂本身固有的缺陷， 具有高效、无毒 、可生物降解等特点，受到广泛关注。如王琴[22]等人以啤酒废水为培养基，研究 了 CO D 浓度 、辅助氮源 、无机盐 、pH 值及培养时间等培养条件对 F 一 12 絮凝活性的影响。-5-结果显示 F 一 12 的最优产生条件为 1L C O D 浓度 10000m g／L 的啤酒废水中加入 0．2g(N H ) SO 、0．2g KHPO4，培养基初始 pH 值为 7．0 、30oC 和 150r／m in 条件下摇床培 48h 。 以啤酒废水为培养基进行微生物絮凝剂产生菌的培养，可以达到“以废治废”和废水资源化利用 的双重目的。芦艳等以啤酒废水为廉价培养基，对絮凝剂产生菌 M3 进行培养，考察外加碳源、 氮源、培养基 pH 值 、培养时间等因素对絮凝剂产生菌絮凝效果的影响。研究结果表明，直接利 用啤酒废水， 无需另外添加碳源和氮源， 只需添加 0． 5％的 KHPO， 温度为 3O℃， 培养基初始 pH 值为 8．5，培养时间 48h，摇床转速为 160d m in。在此条件下所产生的絮凝剂对高岭土悬液絮凝 率高达 9 3 ．5 ％ 1.2.4 利用啤酒废水发酵产氢 氢气是一种清洁和高效的能源。生物制氢作用条件温和 (常温常压 )，其主要 的类型有光合 生物制氢和厌氧发酵制氢 ，后者具有产氢能力高 、反应不需光源 、发酵底物来 源广泛等优点。 金大伟[23] 等人对经热处理后的厌氧污泥利用啤酒废水厌氧产氢的影响因素(温度 、 初始 pH 值和 有机物浓度 )进行了研究 ，研究表明温度与初始 pH 值对厌氧产氢过程均有显著影响 ，最佳温 度为 35℃，最适初始 pH 值为 6．0～7．0 ，在此范 围内氢气产率 、挥发性脂肪酸含量 、总 糖降解率均可获得最大值。 1.2.5 利用啤酒废水发电 微生物燃料电池(M FC )是利用微生物的催化作用将化学能转化为电能的一种装置，它能同时 产生电能和进行废水处理，许多小分子和大分子混合有机物(如葡萄糖 、生活废水 、食品废水 、 化工废水和垃圾渗滤液等)都可以被用作底物 ，大多数底物在产生电能的同时都可以得到很好的 降解。温青[24]等人以啤酒废水作底物，研究了该微生物燃料电池的产电性能和废水处理效果 ，发 现采用双极室连续流 M FC 可以大大提高废水的处理效果 ，对啤酒废水 C O D 的总去除率可达 92．2％一 95．1％，其中阳极室中 C O D 去除率为 47．6％～56．5％。微生物燃料电池的开路 电压为 0．451V ，最大输出功率为 2．89W ／m。 1.2.6 利用微生物处理废水产生微生物油脂 目前，生物柴油原料油脂的主要来源仍然是植物以及动物脂肪，但动物和植物油连满足人们 的使用都困难，无法满足生物柴油生产的需要。微生物油脂资源是可再生利用的资源，可缓解人 类对油脂需求日益增长与自然资源严重短缺的矛盾，开辟微生物油脂这一新的油脂资源的开发和 研究，不仅丰富了传统的油脂工业技术，而且也将是工业化生产油脂的一个重要途径，具有生产 周期短，原料来源广泛不受季节和气候条件限制，可连续大规模进行等特点，第一次世界大战前 ，德国科学家就曾试图利用酵母、单细胞藻类和菌类生产油脂，以缓解当时食用 油脂供应不足的状况，后因战争爆发而中止了研究，其后美国对微生物油脂也作过研 究。但这些多集中在以合成培养基为基质进行培养，利用废水产油脂的研究却鲜有报道。王宏勋等人首次使用甘薯淀粉废水用此为发酵基质， 得到了油脂证实了利用废水产生微生物油脂的可能。 为后来进一步研究微生物利用废水产油脂提供了参考，经过研究发现如斯达油脂酵母等产油脂酵 母所产油脂的脂肪酸组成与植物油相似可以替代植物油用于油脂化工行业，并有望作为生物柴油 产业的新原料，具有良好的应用前景[27],利用啤酒工业废水资源培养产油微生物，不仅可以获得大 量的微生物油脂，还可以缓解或有效处理废水污染问题，对环境保护及循环经济都有积极意义。 目前国内外关于将微生物油脂作为生物柴油来源的研究多集中在在酵母,霉菌产油脂，研究 多集中在在生产多不饱和脂肪酸,且都倾向于采用合成培养基。杜鹃[40 等人采用刺孢小克银汉霉 （Cunninghamella echinulata）菌株在以甘薯淀粉废水的培养基中进行发酵生产，得到了可食用 的菌丝体、高价值单细胞蛋白、天然色素以及微生物油脂等产品，同时还发现在刺孢小克银汉霉 （Cunninghamella echinulata） 菌株的作用下， 随着培养时间的延长残糖量和 COD 均呈下降趋势， 发酵液废水的 COD 在第 11 天达到最低油脂含量可达到 55.3%。郭书贤[27]等人通过对啤酒废水的 培养进行优化， 发现在啤酒生产废水中添加碳源和氮源的 C／N 为 55： 即木糖 28． g／L 和 1( 88-6-硫酸铵 1．0 g／L )，FeC13 ?6H 2O 3 m g／L ，色醇 150 p~m ol／L (在发酵 36 h 时添加)，初 始 pH 5．5 ；用此培养基在摇床转速 120 r／min、温度 28℃下培养斯达油脂酵母 (Lipomyces starkeyi h 可得到菌体的生物量、 油脂产 量、 油脂含量和废 水的 C OD 降解率分别达到 12．28 g／L、4．40 g／L 、35．80％和 50．32％。这说明了利用微生物处理啤酒废水是一条新 的途径，不仅可以降低废水中的 COD 并且产生了微生物油脂等高价值产品。杨悦[38]等人通过以 淀粉厂废水发酵基质，利用 Macrophomina phaseolinaMOD 发酵生产微生物油脂。结果表明，此菌 株能有效利用不外加任何营养物质的玉米淀粉厂废水合成油脂，菌体生长量(干质量)达到 2．218g ／L，菌丝体中油脂产量为 1．005 g／L，油脂含量达到 45．33％，COD 去除率达到 30．68。研 究同样表明通过添加碳源．可溶性淀粉来调整淀粉废水培养基中的碳氮比，以达到提高菌株 MOD．1 菌体油脂产量的目的是可行的。在最佳的发酵 C／N 为 50：1 时，菌株 MOD．1 的菌体 生长量(干质量)、 油脂产量、 油脂含量和 COD 去除率分别为 35． g／L、 532g／L、 60％ 773 19． 54． 和 54．40％。此发酵条件下产生的油脂共检测出 7 种脂肪酸成分，其中单不饱和脂肪酸含量为 70．823％，研究表明利用微生物资源化利用淀粉厂废水发酵生产微生物油脂同时还能降低废水 COD 值的方法是可行的。金红林[39]通过利用淀粉废水为种子液,对产油菌株在稀释废水中摇瓶发 酵进行了 C 源浓度、 源浓度、离子研究、C/N 和发酵天数研究， N 得知在发酵条件：50g/L 葡萄糖， (NH4)2SO40.5g/L， MgSO4? 7H2O2g/L， 柠檬酸 3g/L， 玉米浆 10mL/L， KH2PO41g/L， NaAc5g/L， (NH4)2SO42g/L，pH6.0 的条件下可得到油脂含量达到 13.95%同时生物量达到 20.09g/L 废水中 COD 的含量也有明显的降低.这些都为利用微生物处理废水产生油脂提供了参考证明了该法的可 行性。 1.3 本课题的目的、意义和主要研究内容 1.3.1 目的 本实验的目的是通过产油脂酵母在啤酒废水中发酵产生油脂和单细胞蛋白，同时可降低废水 中的 COD，从而从中挑选出可最优化利用啤酒生产废水的酵母菌株，并对油脂中脂肪酸的组成和 单细胞蛋白中氨基酸组成进行分析,这样最终达到啤酒生产废水的净化和资源化利用的目的。 1.3.2 意义 目前用于生产油脂的原料主要来源于石油和动植物等，而石油储量却在逐年减少，动植物的 养殖业和种植业却在日益饱和，因此多渠道开发其他油脂就成为必然，经过科研工作者数十年的 努力发现利用微生物产生油脂产生油脂是一条很有前途的途径。 我国是啤酒生产大国，2012 年我国啤酒生产啤酒多达 490.2 亿升，而啤酒行业是耗水量较大 的行业 ，虽然各企业间有较大差别 ，但一般说来每生产 1 t 啤酒的耗水量 1O 一 5O 吨，因此每 年的啤酒生产废水多达数亿吨，与此同时我国多数啤酒厂尚没进行综合利用 和废水治理 ，因而 给水环境造成了极大的污染，特别是高浓度的有机污染，为了治理废水企业每年都要投入大量资 金，这样既限制了企业的发展又造成了水资源的严重浪费。根据啤酒生产废水可生化性高的特点， 利用微生物治理是一项很有前景的处理方式，这样在净化废水的同时又可得到微生物自身的发酵 产物。 经过研究发现某些产油脂酵母可利用啤酒生产废水进行发酵生产，在油脂酵母的作用下不但 废水得到净化而且还可以得到生物油脂以及高价值饲料单细胞蛋白， 实现了废水资源的充分利用， 并且产油脂酵母利用啤酒废水产生油脂代价较低不受场地季节限制等因素，可实现连续化生产 为人类提供了新的能源。 通过对油脂脂肪酸组成和单细胞蛋白中氨基酸组成进行分析，为人们进一步研究提供一定的 参考。 1.3.3 主要研究内容 （1）啤酒生产废水水质参数测定 测定啤酒生产废水的总糖、总氮TN、pH、COD。 （2）最适宜菌株的筛选-7-用啤酒生产废水为培养基培养几种不同的产油脂酵母菌株，以产油脂量、产单细胞蛋白量、 COD 和 BOD 为指标， 从中挑选出高产油脂、 高产单细胞蛋白同时又可降低废水 COD 的酵母菌株。 （3）发酵条件的优化 用选出的菌株在废水中进行培养，以产油脂量、产单细胞蛋白量、COD 和 BOD 为指标，利 用单因素实验对种龄、接种量、发酵温度、发酵时间以及发酵 PH 进行实验，优化出该优良菌株 在废水中最适宜的发酵培养条件。 （4）微生物油脂中脂肪酸组成和单细胞蛋白中氨基酸组成的分析 利用气相色谱对油脂的脂肪酸组成进行分析，利用高效液相色谱对单细胞蛋白中氨基酸的组 成进行分析。 1.3.4 技术路线 菌种活化 ↓ 废水预处理（自然沉降离心） 种子液制备 ↓ ↓ 废水水质参数分析 → 废水发酵培养基 ↓ 采样 ↓ 离心 ↓ 油脂组成分析单细胞蛋白组成分析2.本人对课题任务书提出的任务要求及实现预期目标的可行性分析（1）任务要求： 利用啤酒等食品工业废水发酵产生油脂和单细胞蛋白已经成为一条重要的研究方向之一。本 课题以产油脂酵母利用啤酒生产废水进行发酵产油脂和单细胞蛋白既做到了废水的净化和资源化 利用，同时对油脂脂肪酸组成和单细胞蛋白氨基酸的组成进行分析，为以后进一步利用提供了基 础。（2）可行性分析： 南阳市有天冠集团酒精和啤酒等多家发酵企业，给本课题废水采集和研究提供了便利条件。通 过前期查阅了大量文献资料和深入企业调研，拟定了实验方案。我校生化学院现有仪器设备条件 能满足所需的实验要求，指导教师拥有多年丰富的教学科研、经验保证实验过程能顺利进行，所 以本课题是可行的。-8-3. 本课题需要重点研究的、关键的问题及解决的思路本课题的关键技术难点： （1）筛选出在啤酒废水中高产油脂、高产蛋白、同时可以降低 COD 和 BOD 的优良酵母菌株； （2）从发酵液中提取出油脂和单细胞蛋白； （3）对挑选出的菌株的发酵条件的优化； （4）对单细胞蛋白中氨基酸的组成进行分析，此处为难点。 解决思路： (1) 先对啤酒工业废水进行预处理，然后进行水质参数的分析检测，并对其所含营养成分定 量分析，以其为基础发酵培养基； （2）以发酵产油脂、单细胞蛋白、COD 和 BOD 为指标，将不同种菌株分别接入废水培养基， 通过对油脂和单细胞蛋白的提取测定，从而选出可以最优化利用废水的菌株。 (3)以发酵产油脂、单细胞蛋白、COD 和 BOD 为指标，通过单因素实验对种龄、发酵温度、 发酵时间以及发酵 PH 进行实验，从而优化出该优良菌株在废水中最适宜的发酵培养条件。 （4 通过上面的提取利用气相液相等设备对油脂脂肪酸组成和氨基酸组成进行分析。 （5）统筹安排实验以节省试验时间，以免影响试验进程。4．完成本课题所必须的工作条件（如工具书、实验设备或实验环境条件、某类市场 调研、计算机辅助设计条件等等）及实验方案4.1 仪器与设备条件 仪器设备：101-2A 电热鼓风干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司；SW-CJ-2G 超净工作台，苏 州净化设备有限公司；HZQ-B 大型全温摇床，苏州威尔实验用品有限公司；DNP-9082 电热恒温培 养箱，上海精宏实验设备有限公司；TDL-40B 低速离心机，上海安亭科学仪器厂；TDL-40B 高速离 心机，上海安亭科学仪器厂；LDZX-50FB 立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；-20℃冰箱， 嘉兴市德尔电器制造有限公司；752N 紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；PHS-3C 精密 pH 计，上海雷磁仪器有限公司；TG328B 精密电子分析天平；超声波清洗机，宁波海曙科生 超声设备有限公司；天美 TM 7890ⅡGC 气相色谱仪附氢火焰离子化检测器（FID） ，上海天美分析 仪器有限公司；色谱柱为 TM 石英毛细管柱（25 m×0.25 mm×0.25 um） ；浙江大学 T2100 色谱工 作站，浙江大学智能信息工程有限公司。 玻璃器皿：凯氏定氮仪、试管、离心管、烧杯、容量瓶、量筒、棕色瓶、三角瓶、移液管、 酸式滴定管等。 4.2 文献条件 我校及图书馆生化学院资料室拥有较丰富的文献资源，能够满足本课题提供了文献查阅的需 要。 (1)图书类： 《The Yeast, A Taxonomy Study, 4th edn》 《Yeasts Characteristics and 、 Identification》《微生物学》《现代工业微生物学实验技术》《生物化学实验方法和技术》等； 、 、 、 (2)期刊类：&&中国油脂&&、 《微生物学报》《生物工程学报》《菌物学报》《微生物学通报》 、 、 、 等； (3)网络文献数据库：中国知网数字化期刊全文数据库、万方数字化期刊全文数据库、维普期 刊数据库、spring 外文期刊全文数据库。-9-4.3 实验方案 4.3.1 菌种 斯达油脂酵母 Lipomyces starkeyi CICC1809； 热带假丝酵母 Candida tropicalis； 产朊假丝酵母 Candida utilis； Trichosporon porosum D02； Debaryomy cesoccidentals D03； Lipomyces starkeyi J06； 皮状丝孢酵母 Trichosporon cutaneumCGMCC2.571； 皮状丝孢酵母 Trichosporon cutaneumCGMCC2.570； 赖巴克丝孢酵母 Trichosporon laibachii CGMCC2.1972； 球红冬孢酵母 Rhodosporidium sphaerocarpum CGMCC 2.1581； 红冬孢酵母 Rhodosporidium toruloides CGMCC 2.1609； 粘红酵母 Rhodotorula glutinis CGMCC 2.703 小红酵母 Rhodotorula minuta CGMCC 2.1517 以上菌株其中斯达油脂酵母、 热带假丝酵母、产朊假丝酵母 Candida utilis 、 Trichosporon porosum D02、Debaryomy cesoccidentals D03、Lipomyces starkeyi J06 保藏于南阳理工学院南阳市 重点工业微生物实验室；其余酵母均为购买。 4.3.2 废水 啤酒生产废水，来自于南阳市天冠啤酒厂。 [28] 4.3.3 废水预处理 处理上述废水之前， 先用纱布过滤除去大的杂质性物质， 再用自然沉降法处理。 静置沉降 24h， 备用。 4.3.4 培养基制备 （1）活化培养基 [29] YEPD 固体培养基 ：葡萄糖 20g/L，酵母膏或酵母粉 10g/L，蛋白胨 10g/L，琼脂 20g/L， pH 自然。 （2）种子培养基 [29] YEPD 液体培养基 ：葡萄糖 20g/L，酵母膏或酵母粉 10g/L，蛋白胨 10g/L，pH 自然。 （3）发酵培养基 自然沉降 24h 的啤酒生产废水（南阳天冠啤酒厂） 、木糖 28.88 g/L、(NH4)2SO4 1.0 g/L、 FeCl3?6H2O 3.0mg/L、 150μ mol/L 的色醇（36h 后添加） 、调节 pH 5.8-6.0。 以上培养基均在 121℃灭菌 20min。 4.3.5 菌种活化 从 4℃冰箱中取出保藏菌种，划线接种至 YEPD 固体斜面培养基，28℃恒温箱中培养 36-48h。 若必要，可活化两次。 4.3.6 种子液制备 将活化菌种接入两环 YEPD 液体培养基，于 28℃下摇床培养 36h，制备种子悬液，备用。 4.3.7 发酵培养 上面配制的废水发酵培养基在摇床转速为 120 r／min、温度 28℃下培养酵母 120 h。 4.3.8 发酵条件优化 （1）种龄对发酵的影响 分别在 6h、8h、10h、12h、14h 从液体种子培养液中取一定量（10%）的种子培养液接于废水 培养基，在其他培养条件都一样的情况下，120h 后测定发酵液的油脂产量 ρ（g/L） 、单细胞蛋白 产量、COD 和 BOD 降解率。 （2）不同接种量对发酵的影响 由上面的实验得出最适合的种龄，在不同的接种量:5%、10%、15%、20%，分别接种于发酵用- 10 -废水培养基，一定时间后测定测定发酵液的油脂产量 ρ（g/L） 、单细胞蛋白产量、COD 和 BOD 降 解率，确定出最适合的接种量。 （3）不同温度对发酵的影响 由以上两个实验得出的最适种龄和接种量的基础上接种于发酵培养基，分别在 20℃、24℃、 28℃、32℃下e瓶发酵培养，一定时间后测定发酵液的油脂产量 ρ（g/L） 、单细胞蛋白产量、COD 和 BOD 降解率。 （4）不同发酵时间对发酵的影响 由以上确定的几个因素，在此基础上取一定量的种子液接种于发酵培养基，e瓶发酵培养， 分别在发酵 48h、72h、96h、120h、144h 时测发酵液的测定发酵液的油脂产量 ρ（g/L） 、单细胞蛋 白产量、COD 和 BOD 降解率。 （5）不同发酵PH对发酵的影响 由以上确定的几个因素，在此基础上取一定量的种子液接种于发酵培养基，e瓶发酵培养，分 别在发酵 PH 为 5.0、5.5、6.0 和 6.5 条件下发酵培养，经过最适时间后测发酵液的测定发酵液的 油脂产量 ρ（g/L） 、单细胞蛋白产量、COD 和 BOD 降解率，从而优化出最适的发酵 PH 4.3.9 测定方法 [30] 4.3.9.1（啤酒废水中）总糖的测定（苯酚-硫酸法） （1）原理 糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，其颜 色深浅与糖的含量成正比，且在 490nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。 （2）试剂 1 ○6%苯酚溶液 准确称取 6g 苯酚，溶于水，定容至 100mL。 2 ○葡萄糖标准溶液(40μ g/ml) 精确称取己干燥的葡萄糖 20 mg，溶于 500 ml 蒸馏水中。 3 ○浓硫酸。 4 ○蒸馏水。 （3）实验步骤 1 ○葡萄糖标准曲线的制作 吸取葡萄糖标准溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8 ml各加水补至2.0ml，然 后加入6%苯酚1.0 ml及浓硫酸5.0 ml，静置10 min，摇匀，室温放置20min后于490nm测吸光度(A)。 以糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，得标准曲线。 2 ○测定 样品液稀释一定浓度后，取2.0ml，按上述步骤操作，以标准曲线计算糖含量。 [31] 4.3.9.2 总氮的测定（凯氏定氮法） （1）原理 样液中含有的蛋白氮和非蛋白氮经加硫酸消化，使其分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵， 然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定，根据盐酸消耗量，即可求出总 氮含量。 （2）试剂 1 ○硫酸铜。 2 ○硫酸钾。 3 ○浓硫酸。 4 ○2%硼酸溶液。- 11 -5 ○40%NaOH 溶液。 6 ○混合指示剂：0.2%甲基红-乙醇（95%）溶液 1 份和 0.2%溴甲酚绿乙醇溶液 5 份，临用时混 合。其中，0.2%甲基红/溴甲酚绿的乙醇溶液指：0.2 克甲基红/溴甲酚绿溶于 100mL95%的乙醇中。 7 ○0.1NNaOH 溶液 精确称取 4gNaOH 固体，溶解定容至 1000mL，备用。 标定方法：精确称取 0.4g 邻苯二甲酸氢钾（预先于 120℃烘干 2h） ，置于 250mL 三角瓶中， 加 50mL 水溶解，再加入 0.5%酚酞指示剂 2 滴，用 0.1NNaOH 溶液滴定至微红色。 计算: NNaOH = {W/[(M/1)×V]}×1000，其中 W―0.4g，M/1―邻苯二甲酸氢钾克当量 204.2g， V―消耗 NaOH 溶液的体积（ml） 。 8 ○0.1N 硫酸标准液 精确称取 2.8mL 浓 H2SO4，用水稀释定容至 1000mL，备用。 标定方法：准确吸取 20mL0.1NH2SO4 溶液，置于 100mL 三角瓶中，加 2 滴 0.1%甲基红，用已标 定过的 0.1NNaOH 溶液滴定至微黄色。 计算：NH2SO4 = N1V1/V，其中 V―20ml , N1V1 --标准 NaOH 溶液当量浓度与消耗体积（mL） 。 （3）实验步骤 1 ○消化 精确量取液体样品 20mL，小心移入洁净的 500 毫升凯氏定氮瓶中，然后加入研细的 硫酸铜 0.5 克，硫酸钾 10 克和硫酸 20 毫升，轻轻摇匀后，于瓶口放一小漏斗，将凯氏瓶以 45° 的角度斜支于石棉网上，小火加热，待内容物完全碳化，泡沫完全停止后，加强火，并保持瓶内 液体微沸，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热 30 分钟，放冷。 2 ○蒸馏 将消化后的溶液转移入蒸馏烧瓶，加入几粒沸石，小心加入 200 毫升蒸馏水和 40% 氢氧化钠溶液 80 毫升并摇动，再加水 100 毫升，连接蒸馏装置。接收瓶中盛有 2%硼酸溶液 50 毫 升及混合指示剂 3 滴，加热蒸馏。至氨全部蒸出（馏液约 250 毫升即可） ，停止加热前，使吸收液 面与冷凝管下端分离，再蒸馏 1 分钟，然后停止加热，并用少许水冲洗冷凝管下端的外部。 3 ○滴定 以 0.1N 硫酸溶液滴定至灰色为终点，根据消耗的酸量计算含氮量，同时作试剂空白 试验。 4 ○计算 样液中总氮含量（%）=[(V1- V2)×N×0.014/W]×100 式中 V1―样液消耗硫酸标准液的毫升数； V2―试剂空白消耗硫酸标准液的毫升数； N―硫酸标准液浓度； 0.014―1N 硫酸标准液 1 毫升相当于氮的克数； W―样液体积，毫升。 4.3.9.3 pH 值的测定 [32] 4.3.9.4 COD 的测定（重铬酸钾法） （1）原理 在强酸溶液中，用一定量的重铬酸钾氧化水中的还原性物质，过量的重铬酸钾用试亚铁灵作 指示剂，用硫酸亚铁铵溶液回滴。根据硫酸亚铁铵的用量计算出水样中还原性物质的量。 （2）试剂 1 ○重铬酸钾标准溶液（0.2500mol/L） 称取预先在120℃烘干2h的优级纯重铬酸钾12.258g溶于蒸馏水中，移入1000mL容量瓶中，稀 释至标线，摇匀。 2 ○试亚铁灵指示液 称取1.485g邻菲0.695g硫酸亚铁（FeSO4?7H2O）溶于蒸馏水中，稀释至100mL，贮于棕 色瓶。 3 ○硫酸亚铁铵标准液（0.1mol/L） 称取39.5g硫酸亚铁铵溶于蒸馏水中，边搅拌边缓慢加入20mL浓硫酸，冷却后移入1000mL容量- 12 -瓶，加蒸馏水稀释至标线，摇匀。临用前，用重铬酸钾标准液标定。 标定方法：准确吸取10.00mL重铬酸钾标准液于500mL锥形瓶中，加蒸馏水稀释至110mL左右， 缓慢加入30mL浓硫酸，混匀。冷却后，加入3滴试亚铁灵指示液（约0.15mL），用硫酸亚铁铵溶液 滴定， 溶液的颜色由黄色经蓝绿色至刚出现红褐色不退即为终点。 记录硫酸亚铁铵所消耗的体积V。 C = (0.)/V 式中，C为硫酸亚铁铵标准液的浓度，mol/L；V为硫酸亚铁铵标准滴定液的用量，mL。 4 ○硫酸-硫酸银溶液 向250mL浓硫酸中加入2.5g硫酸银，放置1~2 d，不时摇动使溶解。 5 ○硫酸汞（结晶或粉末）。 6 ○浓硫酸（相对密度1.84）。 （3）实验步骤： 1 ○加0.4g硫酸汞到500mL锥形瓶中；加20.00mL水样(或经过稀释处理的水样20.00mL)；再准确 加入10.00mL重铬酸钾标准溶液及数粒洗净的玻璃珠；量取30mL硫酸-硫酸银溶液，缓慢加入锥形 瓶中，轻轻摇动锥形瓶使溶液混合均匀，用纱布盖住锥形瓶口并用麻绳扎牢。 2 ○将锥形瓶放入已加入适量水的高压灭菌锅内，盖上高压灭菌锅锅盖，开启高压灭菌锅电源， 控制高压灭菌锅压力为0.13~0.15MPa，温度为123~126 ℃；从高压灭菌锅达到上述控制要求开始 计时，至40min结束。 3 ○冷却后，将90mL水沿锥形瓶壁边摇边缓慢加入锥形瓶，继续冷却至室温，加3滴试亚铁灵指 示液，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定至溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色，即为终点，记录硫酸 亚铁铵标准溶液的用量V1。 4 ○同时作空白试验，取20.00mL蒸馏水代替水样, 按同样操作步骤。记录滴定空白时硫酸亚铁 铵标准溶液的用量V0。 （4）计算：（以O2计） 1 ○COD=C(V0-V1) ×8 ×1000/V2 式中: C-硫酸亚铁铵标准溶液的浓度，mol/L；V0-滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的体积， mL；V1-滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液的体积，mL；V2-水样的体积，mL；8-氧(1/2)摩尔质量， g/mol；COD-化学需氧量，mg/L。 2 ○测定原液及培养至终点时的离心上清液COD值。 COD 降解率（%）=(原废水 COD-发酵后废水 COD)/原废水 COD×100% [33] 4.3.9.5 菌体生物量的测定 干重法：取发酵液 15mL（VmL） ，经 8000r/min 离心 5min，蒸馏水洗涤 2 次，105℃烘干至恒 重，称量干菌体的重量（m） 。 [34] 4.3.9.6 油脂的提取及含量测算 ： （1） （酸热-有机溶剂法）:将 5mL 发酵液 8000r/min 离心 5min，菌体用蒸馏水洗涤 2 次。用酸热 法提取。按每克湿菌体加 10ml 4MHCl，室温放置 30min，沸水浴 5min，-20℃速冷，加入 2 倍体 积甲醇:氯仿（1:1）提取液，充分震荡后，8000r/min 离心 5min，收集下层氯仿层；再加入 10ml 氯仿，振荡，8000r/min 离心 5min，收集氯仿层；合并氯仿液，加入等体积的 0.1%氯化钠溶液， 混匀，8000r/min 离心 5min；用已恒重的离心管（m1）收集下层氯仿层，挥发除去氯仿，于 105℃ 烘 2h，冷却后称重（m2） ，得油脂量。 (2)计算： 油脂产量 ρ （g/L）= (m2-m1)/V×1000 油脂含量 ω （%）=(m2-m1)/m×100% 油脂系数= (m2-m1)/糖耗量×100 4.3.9.7 油脂脂肪酸组成的的分析方法： 油脂脂肪酸组成分析： 待测样品甲酯化。 色谱柱 ： 石英毛细管柱(25 m x 0． nlin ×0． TM 25 25 Ixm )；柱温 ：175 ℃ ；汽化温度 ：280 ℃；进样量：O．3 ～0．5 IxL ；检测器 (FID )温度 ： 270 ℃。 脂肪酸通过对照标准样品定性， 用面积归一化法确定相对含量。 不饱和脂肪酸指数(IUFA )- 13 -计算 引：IUFA = (1 ×单烯酸含量 + 2 ×二烯酸含量 + 3 ×三烯酸含量 + ? + 几×n 烯酸含 量 ) ×100％[35] 油脂脂肪酸组成分析：待测样品甲酯化。 取样品油 0.1g，加入 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液 2ml，于 65℃水浴中皂化 20min，加入 BF3-乙醚溶 液（1：1）0.2ml，再在 65℃水浴中甲酯化 5min，取出，迅速冷水冷却，加入石油醚 2ml，振荡， 静置 20min，吸取上清液 0.3 uL～0.5uL 作为气相色谱的进样样品。 色谱柱：为 TM 石英毛细管柱（25 m×0.25 mm×0.25 um） ； 柱温：程序升温，150℃保持 1min，以 15℃/min 升至 190℃后保持 5min。 气化温度：280℃； 进样量：0.3μ l～0.5μ l； 检测器（FID）温度：270℃。 定性方法：将测得样品色谱图中各峰的保留时间与脂肪酸标准品的保留时间作比较，确定样 品色谱图各峰的性质。 定量方法：面积归一法。由于同量脂肪酸甲酯各组分在 FID 检测器上的响应值接近，不引入 定量校正因子，各组分含量按下式计算： P（%）=Ai/? Ai ×100% （公式 4-1） ? Ai式中：P（%）――表示组分的相对含量 Ai ――表示组分的峰面积 ――表示各组分的峰面积总和不饱和脂肪酸指数（IUFA）计算：不饱和脂肪酸指数（IUFA）=1×单烯酸含量%＋2×二烯酸含量% ＋3×二烯酸含量%＋??＋n×n 烯酸含量%[36]。 4.3.9.8 单细胞蛋白发酵液中氨基酸组成的分析： （1）酵母发酵液样品的制备 发酵好的培养基须经适当的预处理后才能使用高效液相色谱仪进样分析。其预处理方法如下 : 用 3000 rPmin 离心 15min ,收集上清液;取上清液 10mL 入细长试管中 ,加入 6mol?L 的 HCl 1mL ,减压充氮封管,于 110 ℃下水解 22h ,盐酸水解的目的是使酵母发酵液中的蛋白类物质如月 示、胨、肽等水解为氨基酸 ;最后开管并将水解液全部转移到圆底烧瓶中 ,于旋转蒸发器中进行减 [37] 压蒸发以去除 HCl ,残留物用样品稀释剂溶解并定容至 1mL 即得酵母发酵液样液 （2）酵母发酵液液中氨基酸含量的测定 酵母发酵液样液经盐酸水解、蒸发、定溶 ,最后通过 0.45μ m 针头过滤器过滤 ,即可进样高效 液相色谱仪进行分析氨基酸含量。 本高效液相色谱分析系统是使用带有磺基的苯乙烯--二乙烯基苯 聚合物的 Na+型强酸性阳离子交换树脂对各种氨基酸进行分离、使用 OPA(邻苯二醛 o phthalaldehyde)柱后衍生荧光检测的方法来分离分析酵母发酵液中各种氨基酸的含量。 ①流动相的配制 (配制完毕后均通过 0. 45μ m 滤膜过滤) 流动相 A:柠檬酸钠 58. 8g + 无水乙醇 210mL+ 60 %高氯酸 50mL +高纯水至 3000mL ,再用 60 %高氯酸调节 pH 为 3.20；流动相 B :柠檬酸钠 58.8g +硼酸 12.4g + 4mol/l NaOH 30mL +高纯 水至 1000mL ,再用 4mol/lNaOH 调节 pH 为 10.00；流动相 C:0.2mol/l NaOH 溶液。 ②反应液的配制 缓冲剂 :碳酸钠 122.2g + 硼酸 40. 7g + 硫酸钾 56.4g +高纯水溶解并稀释至 3000mL。 大约 pH 为 10；衍生剂:邻苯二醛 400mg (OPA) + 无水乙醇 7mL + 2 - 巯基乙醇 1mL + 2mL 10 %Brij - 35 溶液+ 缓冲液至 500mL；氧化剂 :缓冲剂 500mL + 10 %次氯酸钠水溶液 0.2mL。 ③色谱条件 固定相 :Na+型强酸性阳离子交换树脂色谱柱 150 ×4.6mm I.D. 5μm，柱温 :55 ℃，流动相 :流- 14 -动相 A 和流动相 B 采用二元梯度洗脱 ,流动相 C 被用来再生离子交换色谱柱；流动相流量 0.3mLPmin； 衍生剂流量:0.2mLPmin ； 氧化剂流量:0.2mLPmin； 荧光检测波长:Ex 348 nm , Em 450 nm；进样量 :10μ l 其中 Pmin 为保留时间。 主要参考文献：[1] 刘书 郑爽英 《啤酒生产废水处理的研究》 [2] 关卫省，李莉莉. 水解酸化+SBR 法处理啤酒废水试验研究[J].长安大学硕士论文，2009. 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产油脂酵母资源化利用啤酒生产废水的研究 开题报告―汇集和整理大量word文档,专业文献,应用文书,考试资料,教学教材,办公文档,教程攻略,文档搜索下载下载,拥有海量中文文档库,关注高价值的实用信息,我们一直在努力,争取提供更多下载资源。}