荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思_百度作业帮
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荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思
荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思
PCR原理中,反应一个循环,PCR产物扩增一倍,即为之前的2倍.……反应N个循环,理论上应为原来的2的N次方.此时,理论的扩增效率是100%,即1.但实际上,由于酶,dNTPs,引物,模板等因素,扩增效率达不到100%.因此,我们就要做标准曲线,看实际的扩增效率是多少,也就是标准曲线的斜率.理论上100%的扩增效率,换算出来的斜率是-3.32.
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n
其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。
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荧光定量PCR技术原理、方法、数据分析详述
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荧光定量pcr标准曲线中的扩增效率太高怎么办做荧光定量标准曲线,同时做内参β-actin和自己的基因SA,结果内参相关系数为1.000,扩增效率为99.7%,SA相关系数为0.990,扩增效率为137.3%,初始模板浓度为2,按-4倍稀释,得怎么
做荧光定量标准曲线,同时做内参β-actin和自己的基因SA,结果内参相关系数为1.000,扩增效率为99.7%,SA相关系数为0.990,扩增效率为137.3%,初始模板浓度为2,按-4倍稀释,得怎么改条件,
1、调整下体系,不要自己配置反应液,最好用商品的MIX,这样各个组分都是最佳的配比.2、三步法改为两步法,退火延伸设置为一步,大部分的温度为60度,这个只是建议,具体看你买的试剂的说明书,会有具体的说明.3、很有可能有非特异性扩增,自己排查下反应体系,根据溶解曲线是否单峰,扩增曲线CT值综合分析.
提高退火温度试试，如果是三步法的话改成两步法试试
哦，请问您可以详细讲解一下两步法和三步法的做法吗，不是很清楚，谢谢
两步法： 95°
30s，40个循环
三步法： 95°
30s，40个循环
两步法比三步法少了72°
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文本预览：
荧光定量PCR技术 与临床应用
西安天隆科技有限公司
PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成 了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后 者又上升成为新的概念。 …
它最大的特点就是能不断推出新形式。
—— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow]
什么是PCR?
我不认为PCR能够用两种“革命”(政 治革命和科学革命)加以说明。……它的发 明并没有改变基因操作的本质。有了PCR， 我们能在更广的范围内更快、更容易地进 行基因操作，学术界也完全不用等到某人 死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一 种新工具。 ——凯利· 穆利斯（Kary Mullis)
PCR只是一个简单的不起眼玩艺
——凯利· 穆利斯（Kary Mullis)
Kary Mullis
PCR及有关技术的发展历史
日Cetus公司的 K. Mullis（第一次成功实验）发明了PCR。 1985年关于PCR 的文章首次由Cetus公 司Saiki等人在 Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim
1987年7月Cetus公司在美国获得PCR基本技术专利批准。 成立于1985年底的Perkin-Elmer Cetus仪器公司于同年的11 月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪。 1989年Science 报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶的发现,预示着 分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的 聚合酶命名为第一个“年度分子”。
1992年3月Cetus公司获得Taq酶、热循环 扩增仪等专利； 1993年Kary Mullis 因PCR的发明获得诺 贝尔化学奖。
PCR反应原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性 依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退 火--延伸三个基本反应步骤构成
PCR反应体系的组成:
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决引物与模板DNA
互补的程度 PCR引物的要求：
引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 引物跨度：以200-500bp为宜 。 G+C含量： 以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。 引物结构：避免出现二级结构、引物间互补、形成二聚体，产生非特异扩增。 特异性： 引物与数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的 结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之 间形成二聚体的机会。
酶及其浓度：
两种Taq DNA聚合酶 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶 一种为大肠菌合成的基因工程酶。
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合 成产物量减少
dNTP：(ACGT)
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切
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