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汉语方位词“上下”与越语“trenduói”的对比研究
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芋螺毒素(conotoxin或conopeptide,或CTX)，由芋螺(Conus)的毒液管和毒囊内壁的所分泌，由许多单一组成的样的混合毒素，主要成分是一些对不同及神经受体高专一性的化合物。每种芋螺的毒液中可能含50~200个活性多肽。不同种芋螺所含各不相同，即使同种芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差别，理论上估计有5万多种不同活性肽存在于芋螺毒液中。芋螺毒素多数由10~40个组成，富含两对或三对二硫键，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽，可作用于各种离子通道和受体的类型及亚型。[1-3]与其他天然肽类毒素相比，芋螺毒素具有相对分子质量小、结构稳定、高活性、高选择性及易于合成等突出优点。它们能特异性地作用于乙酰胆碱受体及其他神经递质的各种受体亚型，以及钙、钠、钾等多种离子通道，不仅可直接作为药物，还可作为理想的分子模板用于发展新药先导化合物，对研究神经生物学也具有重要意义。研究中的疾病治疗范围包括慢性疼痛、、心血管疾病、精神障碍、运动障碍、痉挛、癌症以及中风等。多种具有强神经肌肉阻断作用的芋螺毒素应用于临床麻醉手术的辅助药物也在进行研究，喉部肌肉的快速麻痹有助于气管内插管等手术。中国在这方面起步较晚，1999年才真正开始研究分布在中国的芋螺的毒液。[4-7]外文名conotoxin或conopeptide,或CTX产生器官毒液管和毒囊内壁的毒腺一级学科海洋科技
芋螺是最古老的物种之一，最早出现在5500万年前，属于芋螺科(Conidae)，与锥螺科(Turri dae)、笋螺科（Terebridae）同属于芋螺首科（Conoidea），并且同以具有毒液装置为其特征，但是芋螺科生物毒性最大，种类最多。它们的壳很精巧，花纹美丽且变化多样。栖息在热带海洋的浅海水域，因外形呈圆锥形或芋头状而得名。芋螺具有强大的自然进化能力，单一种属中包括有数百种物种的情况在各种生物中极为罕见，其适应新的栖息域的生存能力极强。快速进化的能力使芋螺成为海洋无脊椎动物中进化最成功的生物之一。全球的芋螺大约有500种，可能是软体动物最大的一个种属。遍布世界各暖海区，中国有芋螺100余种，主要分布在西沙群岛、海南岛及台湾海域。仅少数分布到北部以北的广西和广东大陆沿岸，个别延伸到东海。[8-10]
代表性芋螺图册参考资料。[11][12]芋螺口腔解剖图[13]
芋螺食物种类很广，包括多毛环节动物蠕虫，头足类动物，其他腹足动物，双壳类、鱼和甲壳纲动物。芋螺毒腺[14]根据其捕食习性分为食鱼芋螺、食螺芋螺、食虫芋螺。其中食虫性芋螺最为常见，而食鱼芋螺的毒性最大。捕食时，它具有两种捕猎方式，一种是将毒液释放到周围海水中，较为常见的第二种，迅速伸出形似鱼叉般的牙齿刺入猎物体内，牙齿上具有毒素。它们会向猎物投射接连毒腺管和毒囊的针状齿舌，并注射毒液。猎物一旦被击中，就立刻麻痹，成为芋螺的食物。芋螺毒液是捕食与防御作用的主要武器，毒液的芋螺捕食过程[15]毒性很强，人被刺伤时亦常导致严重伤害，甚至死亡。300年前，就有芋螺毒死采螺人的记录。[12][16-18]根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将芋螺毒素分为A、O、T、M、P、I等多个超家族。α、αA、κA属于A-，ω、δ、κ、μO属于O-超家族，μ、ψ、ΚM属于M-超家族。O-超家族芋螺毒素（半胱氨酸模式C-C-CC-C-C）主要作用于电压门控离子通道（又称电压敏感性通道），包括Ca2+离子通道、Na+离子通道和K+离子通道等。作用于Ca2+离子通道的只有O-超家族的ω-芋螺毒素。在此基础上，根据每个成员保守的半胱氨酸骨架，结合其药理学活性，将之进一步分为若干个家族，按其作用靶位的不同又可将其分为α、αΑ、δ、ε、γ、κ、λ、λ/χ、μ、μO、ρ、σ、ω、ψ等若干个家族。例如：O-超家族，包括ω-、μO-、δ-和κ-芋螺毒素；T-超家族，包括τ-和χ-芋螺毒素；A-超家族，包括α-、αA-和κA-芋螺毒素等。另外，还有一类不含二硫键或者仅一对二硫键的芋螺肽（conopeptide），由于数量少且种属的分布相对稀少，通常直接在其名称后面直接加一个或两个字母来表明其种属来源，如contryphan-R，conantokin-G等。而δ-、μ-、μO-芋螺毒素作用于不同亚型的钠通道，分别属于O、M超家族，统称为钠通道芋螺毒素。δ-芋螺毒素延缓钠流的钝化速度，延长动作电位的持续时间。μ-芋螺毒素分为作用于河豚毒素敏感型（TTX-S）与不敏感型（TTX-R）两类，尤其是TTX-R型μ-芋螺毒素，序列短，活性高，选择性强，已证实具有显著的镇痛效果。[19-23]A-超家族芋螺毒素主要包括α-、αA-和κA-芋螺毒素，通常由10~30个氨基酸组成，含有两对或三对二硫键，且含有两对二硫键的α-家族芋螺毒素都是按照1-3，2-4的配对方式形成loop框架的。因为只有这种配对方式才能够使多肽分子骨架形成“ω”形的稳定的二级结构，才是多肽毒素分子热力学最稳定的构象。三个家族中，其中两个（α-、αA-芋螺毒素）可以选择性作用于nAChR，作为nAChR受体的竞争性拮抗剂；而κA-芋螺毒素则主要作为阻断剂作用于电压敏感型钾离子通道。[11][24-25]A-超家族芋螺毒素的序列分析[13]
A-超家族芋螺毒素的cDNA序列分析发现，它们的信号肽序列具有很高的同源性，而前体肽序列在同一家族中也具有很高的保守性，成熟肽区则显示超变异性，但是各家族的二硫键骨架结构仍然相对保守。但就整个A-超家族芋螺毒素来说，它不像其他超家族芋螺毒素具有完全相同的二硫键骨架结构，在其三个家族中，α-芋螺毒素具有CC-C-C骨架结构，而αA-和κA-芋螺毒素具有完全不同的二硫键骨架结构CC-C-C-C-C，这些结构上的差异也直接导致了他们在生理功能上也有明显的分化和不同。[26-30]
α-芋螺毒素是A-超家族芋螺毒素中分布最广、最高的家族，它们是一些12~30AA的小肽，通常含两个二硫键，有20种α-芋螺毒素的一级结构得到了确证，分别来自不同的芋螺种。α-芋螺毒素是神经或肌肉乙酰胆碱受体的抑制剂。而一种芋螺中同时可能含有6种以上的α-芋螺毒素，其靶位分子均为nAChR受体。已知不同生物物种或同一种物种体内均存在多种nAChR受体亚型，某些生物体内nAChR受体亚型可达16种之多。为了适应此种生态环境，α-芋螺毒素的分子结构不断进化，其二硫键间的loop环框架与氨基酸组成发生变异。单个氨基酸取代即可提高α-芋螺毒素对某一nAChR受体亚型的选择性100倍以上。多样性的α-芋螺毒素可以显著提高芋螺捕食不同生物的能力。[31-32]
对α-EI的NMR结构研究表明，尽管α-EI的结构骨架与其他已知的α4/7芋螺毒素比较吻合，但是其表面电荷分布和部分表面基团位置与α-GI十分相似，也许正是这种分布造成了其对肌肉型nAChR的作用。由此推测毒素对受体亚型的选择性也受到毒素表面电荷和基团的影响。[33]
A-超家族芋螺毒素能选择性阻断nAChRs的某种亚型，使它们可作为鉴定nAChRs及其亚基的有效工具。如：α-CTxMI能特异性结合肌肉型nAChRs的α1δ亚基，而α-CTxMII选择性作用于神经型nAChRs的α3β2亚基。在药理学方面，A-超家族还作为镇疼药物已进入临床研究，Livett等发现的芋螺毒素ACV1具有比吗啡和I-超家族芋螺毒素的前体序列[34]Ziconotide（一种由ω-CTxMVIIA开发的镇痛药物）药效更强和持续时间更长的镇痛效果。它属于α-CTx家族，可能是通过阻断外周初级传入神经元的nAChRs而发挥止痛作用，其给药方便，可肌肉注射或皮下注射，同时也无吗啡的成瘾性和Ziconotide引起的一些副反应（如便秘、呼吸抑制等），极有望开发成为新型高效止痛药物。同时也有望开发成用于治疗焦虑症、帕金森氏病、肌肉紧张和高血压等病症的药物。A-超家族芋螺毒素在探讨毒理药理机制、疾病病因和建立新药物靶位方面均可发挥不可替代的特殊作用。如κA-芋螺毒素对钾离子通道作用位点的阐明对研究治疗心血管系统疾病可能提供新的途径。Codignola等研究表明，α-CTx能结合并阻断小细胞肺癌表面相关的nAChR受体，在小细胞肺癌的诊断和治疗中有潜在价值，这将是CTx的又一个研究领域。[35-39]已发现了几十个I-超家族芋螺毒素（I-CTX），该家族毒素比一般的芋螺毒素要大，并且成熟肽超变异。I-超家族芋螺毒素通常由33~46个氨基酸组成，含有4对二硫键。分子生物学研究发现，每个芋螺毒素均有单一的mRNA编码，原始翻译产物是它们的蛋白前体。前体通常由N-端的信号肽，中间的Pro区和C-端的成熟肽组成。Buczek等对I-超家族芋螺毒素的cDNA序列分析发现其家族成员之间的信号肽序列同源性很低，按信号肽序列可将之分为I1和I2两组。第1组I1-超家族芋螺毒素可视有无翻译后修饰分为A、B两类，其中A类芋螺毒素的C-末端倒数第3个氨基酸一般为Phe、Leu或Met，都是D型，B类芋螺毒素的信号肽和pro区与A类的较为相似，但其成熟肽的长度比A类的短，而且没有翻译后修饰。第2组I2-超家族芋螺毒素没有pro区，而在其前体的C-端有一段约6~13个氨基酸的序列。[40][41][42]根据芋螺毒素作用于生物体内的不同靶位可分为3类：（1）作用于电压门控离子通道的CTX，电压门控离子通道又称电压敏感性通道，常以通透离子（如Na+，K+，Ca2+等）命名。（2）作用于配体门控离子通道的CTX，包括烟碱受体、5-HT3受体、 NMDA受体。配体门控通道又称化学门控通道或递质依赖性通道，后者按相应的受体命名。（3）作用于其他受体的CTX，CTX除了作用于离子通道以外，还有以G-蛋白为靶标的，如：芋螺加压素和芋螺惰性素，以及2种磷脂（conodipine M和PLA2），它们基本上不含有二硫键。按其作用的受体靶可将芋螺毒素分为α、ω、μ、δ等多种亚型。[43-45]
芋螺毒素质谱图册参考资料。[40][41]
所有的芋螺毒素具有几个共同的结构基序，然而在不同的芋螺种中，芋螺肽的序列差异极为显著。按照芋螺毒素的二硫键框架及高度保守的信号肽序列，芋螺毒素可分为若干个超家族，如A、M、O、P、I、S、T等，其中A家族芋螺毒素又分为α-，αA-，κA-三个亚家族。大约一半的已知神经元特异性α-芋螺毒素的三维结构已经确定，其折叠方式也已有共识———由两个保守二硫键支撑的螺旋区域。这些二硫键使α-芋螺毒素具有两个闭环框架特征，半胱氨酸残基和二硫键的缔结方式在整个序列中是不变的，构成了二环的基本框架。α-芋螺毒素共有的主要氨基酸序列中半胱氨酸残基的排列：CCXmCXnC（C代表半胱氨酸，Xm和Xn为非半胱氨酸残基的数量）。一般在上述序列中1/3和2/4半胱氨酸之间形成二硫键。半胱氨酸残基之间氨基酸的数量将α-芋螺毒素分成不同的亚型。这些亚型包括α3/5-、α4/3-和α4/7-芋螺毒素，分别以2/3和3/4半胱氨酸残基之间氨基酸的数 目命名。α3/5-芋螺毒素（CCX3CX5C，如α-GI和MI）拮抗脊椎动物肌肉nAChRs，α4/7-芋螺毒素（CCX4CX7C，如α-MII）对脊椎动物神经nAChRs具有特异的选择性和亲和力。α4/3-芋螺毒素（CCX4CX3C，如α-ImI和α-RgIA）对同聚肽神经nAChRs（α7-α10亚基）和杂聚肽α9α10nAChRs亚基有拮抗作用，而来自Conus purpurascens的α-芋螺毒素PIB（α-PIB）是一种α4/4-芋螺毒素（CCX4CX4C）对脊椎动物神经肌肉nAChRs有高亲和性和抑制活性。[46-48]
芋螺毒素色谱图册参考资料。[34][49]芋螺毒素的命名规则如下：1个希腊字母表明药理学活性，1个或2个字母代表芋螺种属，1个罗马数字表示二硫键框架编号，1个大写字母表示其变异体。如σ-GⅧA中，σ指出药理学活性，G代表地纹芋螺（C.geographus），Ⅷ为二硫键骨架，而A为该类肽的第一个毒素。若只有克隆基因获得的成熟肽序列，就用1个或2个字母代表芋螺种属，1个阿拉伯数字表明半胱氨酸框架，1个阿拉伯数字代表变异体，如Tx5.1、Tx5.2。[50-52]芋螺毒素(Cys残基排列方式-C-C-CC-C-C-)肽链由24~31个氨基酸组成，分别含有3对二硫键成4-Loop框架。Marian Price-Carter等研究了ω-芋螺毒素MVIIA中二硫键对该毒素的稳定性和肽段折叠的影响，发现每个二芋螺毒素碎片图谱[53]硫键均对毒素的稳定构象有重要贡献，缺少任何一个二硫键都会导致毒素变成不规则的二级结构，大幅度降低与钙通道的结合能力，并变得更容易被还原。已利用NMR技术获得了MVIIA，GVIA，MVIIC，MVIID，SVIB，SO3和TxⅦ等ω-芋螺毒素的溶液构象，这些芋螺毒素的整体构象都十分相似，在空间上表现为由3股被转角连接的反平行β-片层所组成，具有稳定的抑制剂半胱氨酸绳结模体的结构，这种保守的结构正是芋螺毒素能作用于钙离子通道上的宏位点的基础，所不同的只是β-片层的长度和β-转角的类型。芋螺毒素的多样性及与受体结合的高特异性是由于Loop区核苷酸序列高变的结果，ω-芋螺毒素对钙离子通道亚型的选择性也正是因为分子中4个Loop区氨基酸序列的超变异。虽然各种ω-CTX的同源性都比较低，但通常第13位是保守的Tyr残基，在第5位是保守的Gly残基，并且通常含有4~6个碱性氨基酸。[54-56]
利用核磁共振光谱法可以确定多种芋螺毒素的三维结构。这些小肽很难形成结晶，但也有几种小肽可以通过X-射线晶体法分析其结构，如具有神经肌肉活性的芋螺毒素GI可以通过这两种方法分析其结构。尽管芋螺毒素是一种小肽，但是它们却能折叠成精细的结构。根据这些结构特征，有可能确定它们一致的结构特征。这些结构上的特性明显受到二硫键的缔结方式和围绕第3个半胱氨酸的一个螺旋区域的限制，这种螺旋的典型特征是覆盖第5~12位的残基。环1（Loop 1）的折叠方式是高度保守的，包括螺旋的第一个转角。主要的差别发生在环2（Loop 2），最为直观的表现就是该环包含的残基数是不等的。然而，即使是在残基数相等的情况下，在4/7型的芋螺毒素中，环1比环2有更好的重叠程度。在这种情况下，结构的差异显然是与氨基酸残基的序列多样性相关而不是氨基酸残基的数量。因此，环2的序列多样性导致了芋螺毒素的多样性，使其对神经元nAChRs具有特异选择性。对具有神经元活性的芋螺毒素进行活性结合实验，有助于研究神经元nAChRs的多样性和受体特异选择性，也可能获得治疗神经性疾病的药物。[57][58-60]
芋螺毒素紫外光谱图[61]
研究发现，毒素分子内部可以自发或经二价阳离子诱发而形成α螺旋结构，Gla在这个过程中起重要作用。在Mg2+-Con-G复合体中，一个Mg2+被Gla3、4、7提供的氧原子稳定，第二个Mg2+与Gla7提供的氧原子相作用，第三个Mg2+与Gla10、14提供的氧原子结合，也即Con-G中存在3个Mg2+结合位点；而Con-T分子内仅有一个Mg2+结合位点。一般认为，生物分子的二级结构能够影响其活性。而研究发现，α螺旋含量与Con-T及各种类似物活性之间并无相关性。放射性配体结合实验也未发现Con-G、Con-R分子α螺旋含量与其活性存在严格相关性。采用微孔膜通透实验研究二级结构的改变对Con-G微孔表观渗透性的影响。结果表明，在Con-G溶液中加入Ca2+，增加其α螺旋结构并未显著改变Con-G在微孔合成膜上的表观渗透性。因此，分子二级结构的改变不会对其NMDA受体拮抗活性产生显著影响，但以上结论仅适用于体外试验，还没有整体动物试验证明该观点成立。[62-63]制备芋螺毒素的方法主要有三种方法。第一种是自天然芋螺毒管中直接提取，此方法获取量非常少，且由芋螺毒素合成路线[64]于海洋生态的破坏使得野生芋螺数量急剧减少，该法会进一步加剧芋螺资源恶化，因此靠分离提取获得大量的芋螺毒素用于研究和生产并不现实，但提取到的少量天然毒液可通过一系列仪器分析手段得到单个毒素肽的氨基酸序列，再根据所得序列人工合成这些肽，可进一步用于活性测试和结构分析。第二种是基因工程方法，即将芋螺毒素的基因转化到微生物中使其表达，后期再进行分离纯化。由于部分芋螺毒素的N端为Cys，酰胺化C端，加之原核表达系统无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决酰胺化C端问题，且芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象，使得分离纯化较为困难。但随着基因工程技术的日新月异，用芋螺毒素成熟肽基因，加接原核或真核生物的信号肽，或同时转入酰胺化酶基因，可望生产出大量廉价的重组芋螺毒素。[61]从芋螺的毒管中可提取少量天然芋螺毒素，大多从野生芋螺的死体毒管中提取。或者引诱活体芋螺刺捕猎物，用乳胶套收集喷射的毒液，可收集到几微升毒液。为了充足供应芋螺，美国研究人员在农场里尝试芋螺的养殖，只养了Conuspurpurascens一种，但还不能辨别活芋螺的性别，也未观察到芋螺的交配行为，这说明暂时无法人工繁殖芋螺。因而，靠从芋螺体内分离提取获得大量的芋螺毒素用于研究和生产是不现实的，天然来源的芋螺毒素十分有限，这制约了芋螺毒素研究的开展和应用。但获得的少量天然毒液可用高效液相色谱仪进行分离和分析，通过质谱仪和序列分析，可得到单个毒素肽的氨基酸序列。[65-66]
研究中使用的芋螺毒大多数是毒液排出管抽提物。对于大多数芋螺种来说，这些抽提物勉强用于研究。但也有例外，如一种产自东太平洋猎食鱼的种类称为紫纹芋螺（C.purpurascens），其抽提物量不足以用于生化研究。可以先将紫纹芋螺饲养在水中洞穴中，用吹胀的塑料套子在金鱼身上摩擦，芋螺从沙子中跑出来，吸吮着套子，随套子浮在水面上。或Eppendorf试管，挖去盖子，放一些鱼鳍在试管中，再在鱼鳍上面放上一层薄膜，芋螺试图吸吮试管，便将毒液排入试管中。每收集3-5mL毒液需要耐心地多次用这种方法不停地累积。[66][67]芋螺毒素是基因直接表达的产物，现代基因工程技术也促进了芋螺毒素的研究与开发。在研究芋螺毒素基μ芋螺毒素基因的串联[36]因的结构和生物合成过程，寻找新芋螺毒素基因，研究其分子遗传学机制，蛋白质折叠机制方面有重要的应用，且已取得了较快的进展。构建芋螺毒素cDNA文库，从中筛选新芋螺毒素基因已成为研究新芋螺毒素及其分子特征的重要途径之一。[68-69]
芋螺毒素在体内先合成较大的无活性多肽前体，它们由50~80个氨基酸残基组成，含有典型的信号肽序列区和可变区，在近成熟肽区位置，有标准的蛋白质水解信号，这些信号肽序列在所有超家族成员中具有保守性。同一超家族的芋螺毒素成员具有高度保守的信号肽序列和高度保守的二硫键连接方式。如MVIIC，MVIID，SⅥA，SⅥB和SO3是根据已知ω-毒素毒素肽氨基酸保守序列，合成特定的探针，从中筛选出来的。其他国家已构建了织锦芋螺（C.textile），幻芋螺（C.magus），地纹芋螺（C.geographus），金翎芋螺（C.penaceus）等几种芋螺的cDNA文库。同时根据信号肽及3’端非翻译序列，设计芋螺毒素各个超家族基因的特异PCR引物，从cDNA和基因组DNA中克隆新型毒素基因成为可能，且是分离芋螺毒素基因的主要方法。[70-72]
研究人员从3种芋螺（C. livi-dus、C.abbreviatus和C.ebraeus）中测出了284个四环芋螺毒素前体蛋白基因序列，又从另外5种芋螺（C. arena-tus，C.pennaceus，C. tessulatus，C.ven-tricosus和C. textile）中获得了170个芋螺毒素的cDNA序列。他们都在GeneBank中申请了序列号。中国海南浅纹芋螺（C.striatus）和织锦芋螺（C. textile）中也分别发现了6种新O-超家族毒素的cDNA序列和2种α-CTX。地纹芋螺（C.geographus）基因组DNA则用PCR法克隆到新型α-CTX GIC。[13][34][49][73-75]
中国海南产的大理石芋螺（Conus marmoreus Linnaeus）、幻芋螺（Conus magus Linnae-us）、信号芋螺（Conus litteratus Linnaeus）、勇士芋螺（Conus miles Linnaeus）、独特芋螺（Conus caracteristicusFischer）、织锦芋螺（Conus textileLinnaeus）、桶形芋螺（ConusbetulinusLinnaeus）、疣缟芋螺（Conus livi-dusHwass）等共三种芋螺的基因组 DNA 电泳图[14]12个种中分别发现了具有药用功能的35种O-超家族芋螺毒素肽及其基因。根据毒素基因推测出相应的毒素氨基酸序列，通过人工合成或基因体外重组表达出这些芋螺毒素，进一步研究其活性，这些毒素即是新药开发的候选药物和先导药物。但部分ω-芋螺毒素的N端为Cys，C端酰胺化，加之原核表达系统无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决C-端酰胺化问题，且ω-芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象。[76]采用人工化学合成的方法，即通过分离天然芋螺毒素后测序或采用基因克隆方式获得芋螺毒素序列，然后二硫键形成方法示意图[77]采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素，较多使用的是多肽固相合成法。与传统的多肽液相合成法相比，该法具有如下优越性：只需经过过滤和冲洗，就可以将产物多肽从可溶性试剂中分离开来；易于使用自动化设备；过量的反应试剂促使反应彻底进行；反应产物多肽一直结合在固相载体上，损失量将达到最小。根据氨基端保护基的不同，固相合成芋螺毒素常用方法为Fmoc法和Boc法。Fmoc法具有反应条件温和、副反应少等特点，大多芋螺毒素的合成都采用该方法。合成后将肽链从树脂上裂解下来，常用的裂解剂为reagentK试剂（trifluoroaceticacid∶water∶ethanedithiol∶phenol∶thioanisole，90∶5∶2.5∶7.5∶5）。接着脱去侧链保护基、复性、纯化，即可得到与天然毒素活性相同的肽，也可以合成其同系物进行结构和功能的研究。但由于ω-芋螺毒素氨基酸残基较多，一般都在25个以上，其人工合成的产率较小，纯度也低，合成的肽还需氧化折叠才能形成正确的构象。氧化折叠的方法有空气氧化法、DMSO、DTT/cysteine、gluthatione氧化法等。[78-82]
研究人员在合成ω- CNVIIA时，对这几种氧化折叠方法作了比较，发现gluthatione氧化法效果最好。随后进行纯化，即可得到具有天然毒素活性且纯度较高的多肽，最后利用NMR技术进行构象分析。因此，人工合成芋螺毒素的成本较高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。但由于芋螺毒素药物的用量小，效果好，价值高，可部分满足市场需求。[83-84]随着对芋螺毒素研究的深入和多肽合成技术的进步，芋螺毒素的合成方法也不断改进。Ale-wood小组将硒代半胱氨酸引入，合成了3个α-芋螺毒素ImI的类似物。具体操作是用硒代半胱氨酸代替了其中的1对或者2对半胱氨酸，形成二硒键替代了原有的二硫键，显著提高了芋螺毒素的氧化折叠效率，NMR和CD谱都表明类似物和天然的ImI在结构上十分相似，并且保持了原有的生物活性。可采用硒代半胱氨酸代替半胱氨酸合成了μ-芋螺毒素SIIIA类似物，并且使用同位素标记了1对半胱氨酸，在提高了合成效率的同时确定了二硫键的连接。[85-86]
有研究人员在利用法合成了α-芋螺毒素MII的过程中，比较了使用微波合成法和经典的合成法。结果表明使用微波合成的产率更高，从77%~89%提高到75%-93%。更重要的是使用微波加热缩短了每个反应周期的时间，由1-2h减少到12-15 min。如果把微波用于环状肽α-芋螺毒素IMI合成，合成效率也有所提高。此外，芋螺毒素的合成还有很多其它的策略，如μ-MrIA和α-MII采用N-C骨架环化的方法合成。还有科学家利用内酰胺、硫醚等代替二硫键，研究芋螺毒素的折叠产率。[87-93]芋螺毒素的化学合成是获得芋螺毒素的重要方法，也是进一步研究芋螺毒素活性与结构的基础。关于芋螺毒素线性肽的合成研究已较深入，合成过程中最主要的问题是二硫键如何正确连接。针对不同的芋螺毒素合成，一般是在原有研究基础上，进一步摸索适宜的保护基团和折叠方法。在线性肽的合成过程中，应优化反应试剂，减少副产物的形成，缩短反应时间，提高合成效率。[94-96]芋螺毒素 LtIA线性肽粗肽的色谱图[97]
自从20世纪80年代中期合成α-芋螺毒素GI和MI以及ω-芋螺毒素GVIA以来，有数百种芋螺毒素肽都通过多肽固相合成法（solidphase peptide synthesis，简称SPPS）合成。方向是从C端到N端。每一个氨基酸连接由以下几个过程组成：首先是去保护，即保护氨基酸必须用一种碱性溶剂去除氨基的保护基团；其次是氨基酸活化，即下一个连接的氨基酸羧基被一种活化剂所活化；最后是偶联，活化的单体和游离的氨基反应，形成肽键。以上3步循环进行，直至所需的肽合成完毕。[98-99]芋螺毒素 LtIA线性肽的质谱图[78]
在合成过程中，氨基酸保护基团对合成有着重要影响，特别是一些易于氧化的氨基酸，如Met，Trp等，选择适宜的保护基团可以减少副反应发生。由于芋螺毒素富含半胱氨酸，所以在合成时半胱氨酸保护基团需要慎重考虑。在固相合成中，半胱氨酸有10种以上的保护基团供选择。这些保护基团对酸碱或金属离子的稳定性不同，可以根据这一特点脱去保护基团，从而可以形成游离的巯基、硫醇盐或者直接脱去保护基团且同时形成二硫键，在这个过程中，切割液起着决定性作用。S-Trt、S-Tmob、S-Xan是芋螺毒素合成中常用的半胱氨酸保护基团，对酸不稳定，因此可与其它的保护基团一起用TFA等切割液脱去形成游离的巯基。S-Acm对酸很稳定，可用于Boc或Fmoc合成中，一般用I2或者Tl（tfa）3直接脱去并同时形成二硫键，也可以在汞盐的条件下脱去并形成游离的巯基，这时要注意His，Met，Trp或者Tyr，它们都有可能被氧化。在Boc合成中，最常用的保护基团是S-MeBzl和S-MeOBzl，它们都对TFA很稳定，但可以用HF脱去。若S-Fm用作半胱氨酸的保护基团，就能先于树脂被脱除。适宜的氨基酸保护基团可以减少合成过程中的副反应，提高合成效率。[100-101]多肽固相合成中常用的半胱氨酸保护基团[13]
由于天然芋螺毒素含有特定的连接方式，因此如何合成特定二硫键连接方式的多肽成为合成中最大的难题，也是限制获得大量天然芋螺毒素的关键因素。在芋螺毒素合成过程中，二硫键形成一般通过以下两种方法：第1种为游离的巯基形成二硫键；第2种为半胱氨酸脱保护直接形成二硫键；，因芋螺毒素一般含有多对二硫键，一般情况下需综合使用上述两种方法。游离的巯基形成二硫键在芋螺毒素的合成过程中，半胱氨酸的保护基团如果是S-Trt、S-Tmob、S-Xan等，经过切割后就会形成游离的巯基，这些巯基需进一步自由氧化形成二硫键。这是芋螺毒素合成最常用的策略。游离的巯基形成二硫键的方法有多种，如空气氧化法、氧化法、固相试剂法、铁氰化钾氧化法等。一般认为此法形成的终产物受热力学控制，反应产物为水，纯化步骤少。但由于芋螺毒素含多个半胱氨酸，自由氧化后会形成多种同分异构体。含两对二硫键可以形成3种异构体，如α、ρ、τ、χ等家族芋螺毒素。如果含有6个半胱氨酸理论上会形成15种异构体。研究者已经摸索多种方法，研究体外条件下二硫键形成的机制。结果表明芋螺毒素本身的性质和外界因素都对二硫键的连接有着一定程度的影响。如Shigeiu等研究了盐浓度和温度对ω-芋螺毒素MVIIC折叠的影响。结果显示在5℃时氧化的效果最好，天然构象的产率随着温度的上升而下降，而2.0mol·L-1（NH4）2SO4可以大大提高ω-芋螺毒素MVIIC的正确折叠效率。Cruz等研究了去污剂对疏水性δ-芋螺毒素PVIA氧化折叠的影响，结果表明加入去污剂后天然产物的比例大大提高。Miloslavina等研究了离子化溶液对芋螺毒素折叠的影响，结果表明离子化溶液可以提高亲水性和疏水性肽的氧化折叠效率。此外，前体肽和二硫键作用以及酰胺化等对芋螺毒素二硫键形成也都有一定程度的影响。半胱氨酸脱保护定点形成二硫键芋螺毒素含有多对半胱氨酸，每一对半胱氨酸可以采用不同的基团保护，合适的脱保护试剂脱去保护基团，定点形成二硫键，这是形成芋螺毒素二硫键正确连接的常用方法之一，此法可以定点形成二硫键，为构象研究提供了方便，但也需要注意Met、Trp等这些敏感的氨基酸可能会发生副反应。含有2对二硫键的α-芋螺毒素GI即采用此种方法被合成，其半胱氨酸分别用Acm和MeBzl保护，用HF/anisole脱去MeBzl保护基团，铁氰化钾氧化形成第1对二硫键，然后利用I2脱去Acm并且直接形成第2对二硫键，合成α-芋螺毒素GI时，在脱去MeBzl的同时，树脂也被切割。而Alewood等对定点合成α-芋螺毒素GI进行了进一步探索，即首先在树脂上形成二硫键，最后切去树脂，具体为先用巯基乙醇/DIEA/DMF脱去Fm保护基团形成第1对二硫键，之后再利用I2脱去Acm并且直接形成第2对二硫键，最后才使用HF脱去树脂。[102-106]
另外，还有一种新的定点形成二硫键的方法，称为一罐法（One-pot method）。即两对半胱氨酸分别用t-Butyl和4-methylbenzol基团保护，在5%DMSO/TFA和25℃条件下，t-Butyl保护基团被脱除，再将温度升高到70℃脱去4-methylbenzol基团。研究人员利用两步法和一罐法均合成了α-芋螺毒素ImI，并且比较二者合成效率，结果表明一罐法合成效率更高。[57]
O-、M-等超家族芋螺毒素比较特殊，因为含有3对二硫键，一般自由氧化和定点形成二硫键相结合来合成。如ω-芋螺毒素MVIID，此肽含有6个半胱氨酸。首先用S-Trt保护Cys1，Cys3，Cys4，Cys6，Cys2，Cys5用S-Acm保护。先用切割液脱去树脂和S-Trt保护基团，形成4个游离的巯基，空气氧化形成2对二硫键，剩下的1对保护基团采用I2脱去并形成第3对二硫键。含有3对二硫键的芋螺毒素还可以采用三步法合成，即每一步都形成1对二硫键。Durieux等利用S-Trt，S-Acm和S-MeOzl3种保护基团，分3步切割形成二硫键合成了ω-芋螺毒素MVIIA。[107-109]分子生物学研究结果表明，大约有5~10个主要芋螺毒素基因超家族编码80%以上的芋螺毒素。超家族又分化为结构与功能不同的若干芋螺毒素族，毒素族具有特定的毒理作用靶位，毒素族的各个成员分别专一性的作用于不同类型或亚型靶位分子。芋螺毒素的这种分子多样性对于芋螺的生存竞争有着重要意义，为了适应此种生态环境，α-芋螺毒素的分子结构不断进化，其二硫键间的loop环节与氨基酸组成发生变异。[110-113]芋螺毒素氨基酸序列[114]
每个芋螺毒素均由单一的mRNA编码，通过核糖体翻译机制进行生化合成，原始翻译产物是一种特定的前蛋白原前体化合物，约为70~120AA，包括一个大约20AA的N-端信号肽，一个中间前体段和一个大约10~30AA的成熟毒素段，成熟毒素段常为由C-端编码的单一拷贝区段，生成的毒素片段可在经过不同程度的翻译后修饰，许多芋螺毒素是基因多肽产物中高度翻译后修饰的产物。前蛋白原前体的不同区段的进化速率很不相同，同一超家族的信号肽段是高度保守的，与之相反，成熟毒素段却是高突变的，可能前蛋白原的信号肽段、中间前体段和成熟毒素段是分别由不同的较小的外显子编码形成，这些外显子被较大的内含子片段相互隔断，内含子片段可以调控复制、重组等功能，使前体分子C-端部分加速进化。芋螺毒素的多样性主要来源于成熟毒素段的高突变作用，在一定进化时段内，芋螺毒素利用组合库方式或称为盒式转化机制的方式快速构造新的毒素多肽序列，同时保留高度保守的二硫键排布方式。前蛋白原前体中有一个可由翻译后修饰酶类识别的特殊信号肽段，多种翻译后修饰过程进一步生成更多新序列的芋螺毒素分子。常见的翻译后修饰方式有谷氨酸的γ-羧基化，大约有20%的芋螺毒素存在γ-羧基谷氨酸，使之利于阻断NMDA受体。另一种翻译后修饰方式是L-氨基的氨基酸的差向异构化作用，将色氨酸与亮氨酸转换成D-型，则可以提高其对某类亚型受体的特异性。[115]
由于芋螺毒分子生物学研究起步较晚，故对其结构特征了解较少。在基因水平上已阐明来自食螺芋螺，织锦芋螺的σ-TXIA，σ-TXIB和σ-TXIIA（KK肽家族）的结构特征。对其CDNA克隆进行分析获知，这3种毒素的多肽前体由7778个氨基酸残基（AA）组成，编码N端51个AA的核苷酸序列为保守区，其中包括一个插入序列（29个AA）和一个信号序列（22AA），在成熟肽中，该部分被加工去除，C端为成熟肽区域，由26~27个AA组成，6个Cys 100%保守，位于它们构成的环状区的AA具有高变性，即每改变一个AA就有可能形成一种新的芋螺毒素。芋螺毒素在体内先合成较大的无活性多肽前体，多肽前体翻译后加工过程可能是：①由信号肽酶将N端信号肽序列连同插入序列一起切除；②前体的C-末端序列为：X-Gyl-Y-B，B是碱性AA（Arg或Lys），Y是碱性AA或其它AA。在KK肽中Y是Lys，在GVIA中Y是Thr，X是成熟肽C末端AA。先由特异的羧肽酶将C-末端AA切除，之后由一种特殊的α-酰胺化酶将Gly切除，并将X酰胺化。不同种芋螺多肽前体C-末端AA序列不同，表明不同种芋螺在进化中可能形成了特异性不同的酶。芋螺毒素肽翻译后加工的过程中，二硫键交叉形成可能是受到每个肽超家族专一分泌途径中特别细胞组分的援助。每个超家族的高度保守信号序列在每个肽靶向其适合的分泌途径起着特殊的作用。从芋螺基因的分子分析，表明肽前体的不同片段是以相当不同的速率进化的。在同一超家族中的肽的信号序列是相当保守的，相反，成熟毒素肽区是超变异的。至少在一些超家族，信号序列、前区和成熟毒素肽区分别由不同的小外显子编码，这些小外显子被大内含子相互间隔开。因为大内含子可能调节着复制、重组事件，导致前体C端的加速进化和N端十分保守。[64][116-118]芋螺毒素结构模拟图[119]
芋螺毒素肽表现出分子多样性是通过成熟毒素肽区的超突变，芋螺在进化历程上正使用一种重组战略以便在毒液中产生新的肽序列，同时保留肽的基本结构框架。因此，很显然，芋螺毒液是芋螺捕获猎物的主要武器，也可能被当作其它生物学目的（如防卫）。毒液的内容物以很多方式提供了生物体相互作用的生化反射，这种生化反射对该芋螺的竞争胜利或失败是必需的。在一个特殊芋螺种竞争胜利的小生态环境中，可能对毒液的个别组分有连续性的自然选择。当一个新的种进化时，也许因为环境突然改变，捕食者、被捕食者和竞争者三者变化着的关系可能对毒液的其他组分产生新的和巨大的选择压力。在这些不稳定因素下，毒液的组分明显成熟过度，以致于在相对短的时间内，新种的出现伴随着为适应已改变了的生态小环境而其毒液肽的新组成的出现。因此，可论证地说，芋螺属已变成所有海洋无脊椎动物属中物种最丰富的属。通过这种扩增成数百种种，毒液的基本战略保持相同：即几个基因超家族的多样化衍生出来的小的结构肽类，强力地影响捕食者、被食者和竞争者的神经系统。[77][120-121]芋螺毒素是所发现的翻译后加工最为复杂的生物多肽。成熟毒素段的高度翻译后修饰则是芋螺毒素多样性的另一个重要途径。蛋白前体中有一个可由翻译后修饰酶类识别的特殊信号肽段。多种翻译后修饰过程进一步生成更多新序列的芋螺毒素分子。常见的有谷氨酸γ-羧基化、脯氨酸羟基化、C末端酰胺化，此外还有一些罕见的修饰，例如丝氨酸和苏氨酸的糖基化、溴代色氨酸、D型氨基酸、酪氨酸磺基化等。[122-126]μ芋螺毒素基因序列分析图[127]
CTx中A-超家族芋螺毒素中最常见的加工方式是C端的酰胺化和脯氨酸的羟基化；另一种翻译后修饰方式是L-氨基的氨基酸的差向异构化作用，将色氨酸或亮氨酸转换成D-型，则可以提高其对某类亚型受体的特异性。同时发现了一些其他的修饰，如Ser糖基化及Tyr的磺基化等。芋螺毒素分子的翻译后修饰的重要作用在于可使单一基因生成结构不同的多类肽分子结构，大大增加了芋螺毒素分子的多样性。通过翻译后修饰也可以生成不同于母体分子结构的新肽分子模体，提高对靶位分子的识别能力与专一性，同时这些结构变化也常能提高芋螺毒素对蛋白酶的抗性。另一些翻译后修饰的重要作用是改变其物理化学性质，如丝氨酸和苏氨酸的羟基的O-糖基化作用可增加毒素分子的稳定性以及与膜转运分子的亲和性，苯丙氨酸的卤化作用可以增加分子的脂溶性，使之易于透过血脑屏障，进入中枢神经系统。动物实验研究表明，达到同样的活性需要的剂量未糖基化的比糖基化的高10倍，显然O-糖基化增加了毒素的效率。这些氨基酸的修饰与加工均需要特定的酶，同时也需要相应的识别序列或者特征结构，对芋螺毒素而言，对其结构与功能至关重要的可能是蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）。[128-131]放射性配体结合实验常用于评价单个氨基酸被替代后的活性。由于Gla比较特殊，首先引起人们的关注。研究发现，Con-G[γ4A]活性完全丧失；Con-G[γ3A]活性较原肽段下降20倍；Con-G[γ10A]、Con-G[γ14A]活性无明显改变；Con-G[γ7A]对啮齿类动物和人类神经细胞，活性均增加4倍，这表明，Con-G中第4位Gla很重要。对Con-T的研究表明，3位Gla替换对原肽段活性影响较大；4位Gla为维持活性所必需，无论用何种氨基酸替换后，所得类似物均无活性。10位Gla被取代后活性稍降低，14位Gla被替换后活性增加1倍。放射性配体结合实验研究除Gla以外其他氨基酸发现，Con-T[Q6A]活性增加两倍，其余类似物活性均不同程度下降。这说明Con-T中，第6位氨基酸重要性相对小，其余氨基酸对于维持Con-T活性都是必需的。全细胞电压钳实验结果表明，Con-G的5位Leu和Con-T的10~21位氨基酸是影响其配体-NMDA受体亚基选择性的重要因素。所以，进行conantokins分子改造时不仅要保留重要氨基酸位点，而且还要尽量保留影响配、受体亚基结合的结构。以便在提高conantokins类似物活性的同时，保持其与NMDA受体相对高的亲和力。[132-133]
N端相对保守，对于维持肽段活性意义重大，分子设计应该尽量不作改变；C端相对次要，在有限的范围内减少若干氨基酸残基，虽然肽段活性降低，但可通过增大给药剂量来维持原有效应，且减少氨基酸数目可缩小分子，有可能使conantokins经外周给药即可透过血脑屏障进入中枢，简化其给药方式。[134]20世纪60年代在澳大利亚首次发现芋螺猎食鱼类。研究证实不同芋螺毒具有不同的生物活性组分。1997年从芋螺毒中纯化一个活性肽，并成功测定了其氨基酸组成，这个肽就是μ-芋螺毒素。第一个被弄清氨基酸序列并被化学合成验证了的芋螺毒活性肽是α-芋螺毒素GI，它是从地纹芋螺（Conus geographus）毒中纯化出来的，含2个二硫键，由13个氨基酸残基组成，是一种烟碱能型强拮抗剂，其作用类似于蛇毒神经毒素（如α-bungarotoxin，Cobratoxin）。紧接着从地纹芋螺毒中分离鉴定出另一种活性肽，是钠通道的阻断剂，其作用类似于Tetrodotoxin和Saxitoxin，它可引起哺乳动物麻痹反应。这两种肽是引起采螺人死亡的主要原因。[119][135-138]芋螺毒素在肌肉接头部位作用模拟[11]
通过观察了对小鼠和金鱼注射contryphan-R后的行为学表现发现，对金鱼肌肉注射后，金鱼很快出现震颤、麻痹等症状。对小鼠颅腔注射时，低剂量（0.5～6.0nmol/g）可产生骚抓、舔咬、竖尾、桶状翻滚症状等；高剂量（8～20nmol/g）则会表现出抽搐、惊厥、瘫痪乃至死亡。产生这些行为学异常的具体机制尚不清楚。芋螺毒素特异性地作用于多种离子通道与神经受体，对鱼的毒性多在1~10μg/Kg之间。[139-140]20世纪80年代初，美国犹它大学的研究人员直接将芋螺毒组分注射到哺乳动物中枢神经系统，而抛开当时该实验室乃至大多数实验室已长期惯用的所谓的标准方法即腹腔内膜注射法(i.p.)，结果显示，用颅腔注射法引发了大量的小白鼠不同的行为症状反应，这揭示了芋螺毒的药理多样性；而用i.p法，只有很小比例的小白鼠产生稳定可测的症状反应。为了进行针对性研究而从这些症状反应中选择了一种“似睡”现象，把从芋螺毒中分离出的控制这种“似睡”现象的活性组分命名为“睡虫”肽(sleeper)，它能使年龄不到14天大的小白鼠进入“似睡”状态。而如果将这种“睡虫”肽注射到年龄为21天大的小白鼠颅腔，小白鼠却表现出超活跃症状反应，即小白鼠不停地在笼子四周边缘攀爬且从一角落跑到另一个角落。正因这种肽能诱发不同年龄大小的小白鼠表现出不同的症状反应，所以人们又将其称为“睡虫或爬虫”(sleeper or cleeper)肽。还有人从芋螺毒中纯化了“摇荡”肽(shaker)，该肽引发小白鼠颤抖。[141-143]
逐渐减少睡眠肽的C端氨基酸残基后其活性逐渐下降，保持其活性存在的最短肽段为Con-T。而减少Con-R的C端氨基酸残基数目，其活性下降不是十分明显，Con-R尚且能够保持原始肽段活性不变，但是从Con-R开始，活性便逐渐下降，保持Con-R活性存在的最短肽段为Con-R。Con-G活性受C端氨基酸残基数目影响较大，Con-G活性逐渐降低，保持Con-G活性存在的最短肽段为Con-G。Blandl等发现，Con-R诱导小鼠睡眠持续时间为2~4 h，小于Con-R引发的6~8 h睡眠时间。由于放射性配体结合实验显示两肽段的活性相同，因此推断是由于Con-R分子C端的二硫键结构导致其体内半衰期延长，进而延长了小鼠睡眠持续时间。[144-145]
从幻芋螺(C.magus)毒中纯化的“摇荡”肽(shaker peptide)和从地纹芋螺(C.geographus)毒中发现的另一个“摇荡”肽都能抑制青蛙神经肌肉连接处的钙流和突触传递。这表明“摇荡”肽可能作用于控制神经递质释放的一种新型钙通道。采用电生理技术分析鉴定新钙流研究“摇荡”肽影响钙通道及钙流，结果发现了一种新型钙导，即N-型钙流，这些“摇荡”肽专一地强有力地抑制N-型钙流。这些“摇荡”肽就是μ-conotoxinGVIA和μ-conotoxinMVIIA。在神经科学领域，μ-conotox-inGVIA可能会成为仅次于Tetrodotoxin的一种研究工具探针，因为它在抑制突触传递和判断N型钙流是否存在这两方面很有用。[146]芋螺毒液中均存在众多的不同化学结构的芋螺毒素，但是它们并不是随机性的化学产物，而是有重要生物 意义的不断进化优化而生成高生物活性肽，在毒理作用上它们之间具有密切的协同作用，在实现其捕食其他生物的过程中，芋螺并不依赖于某一单一毒素的作用，而是依赖于芋螺毒液中各种毒素的组合作用机制来实现。例如，地纹芋螺毒液中既含有高强度的nAChR拮抗剂（ω-芋螺毒素，又含有Na+通道阻断剂μ-芋螺毒素，前者作用类似于α-银环蛇毒素，后者作用类似于河豚毒素，在这两类芋螺毒素的共同作用下，导致神经肌肉传导完全阻断。[147-148]
芋螺毒素构象图册参考资料。[72][149]
芋螺毒素的组合作用机制突出的表现为不同毒理作用之间的协同组合上，亦即以高度组织化的“毒素集团”发挥其功能。已经了解的此种组合作用机制有两种模式。一种模式称为“休克+麻痹”作用，如紫芋螺（C.purpurascens）有两类不同作用的毒素，一类毒素可致被捕食生物立即产生类似电休克式的强直性瘫痪的快速作用，此类芋螺毒素包括可抑制Na+通道失活的δ-芋螺毒素以及抑制K+通道的κ-与κA-芋螺毒素，这些毒素可迅即使轴突纤维完全去极化，导致休克症状。紫芋螺毒液中的另一类毒素包括多类α-及μ-芋螺毒素，则可完全阻断神经肌肉传导，使被捕食生物长时间瘫痪，在这两类不同作用的毒素的共同作用下，紫芋螺等一些食鱼芋螺，既可以迅速捕捉鱼类，又能从容的吞食它们。另一种模式称为“安定+麻痹”作用，如地纹芋螺，被捕食生物进入其口腔时，并不发生被刺咬时常出现的惊厥状况，而是非常安静，表明地纹芋螺使用了不同于“休克+麻痹”的另一种模式，地纹芋螺中富含Conantokin-G、Contulakin-G等芋螺睡眠肽类，这些肽类可使被捕食生物感觉系统钝化失活，处于安定睡眠状态。然后再在α-及μ-芋螺毒素的作用下，进入麻痹瘫痪期，达到捕食目的。[114][150]电压门控离子通道超家族是由一大族结构相似的膜结合蛋白组成的，它们受跨膜电压变化的激活。这些蛋白质对单价阳离子具有不同的选择性，按照惯例被分为Ca2+，Na+，和K+通道。这些离子通道的最重要的生理作用是促使细胞电信号的产生、调整和转换。电压门控离子通道的主要孔洞形成α-亚基是由含有4个同源结构域的单一亚基组成的（如Na+和Ca2+通道），或由4个不同的亚基组成（如钾通道）。α-亚基与辅助亚基相互作用并不是完整地形成一个孔洞，而是改变α-亚基的特性。在某种生理状态下，当电压门控离子通道被激活时，会经历一个构象变化，致使阳离子选择性地透过通道蛋白的孔洞。这种处于开放状态的电压门控离子通道可被其另外一种构象变化失活、从而使通道进入不传导状态，或者回到关闭状态。电压门控离子通道是多种生物毒素的作用靶标。越来越多的可与Na+，K+，和Ca2+通道的成孔α-亚基相互作用的芋螺毒素家族被研究鉴定。已知有3个不同的芋螺毒素家族作用于电压门控离子通道，μ-CTX是Na+通道阻断剂、μO-CTX抑制Na+通道的电导率、δ-CTX延迟或抑制Na+通道的快速失活。只有ω-CTX作用于Ca2+通道。[151-152]
Ca2+通道为所有兴奋性细胞膜的必要成分之一，Ca2+通道是由4或5个不同的亚基组成的复合物。观察到的Ca2+通道在生理学和药理学上的多样性主要是由成孔α1-亚基的特性形成的。据此可分为L，T，N，P，R和Q类型，其中N类型的Ca2+通道只存在于神经元组织（如脊椎动物的中枢神经系统以及外周神经系统），它主要抑制神经递质尤其是去甲肾上腺素从交感神经上释放时Ca2+的进入。基于不同的生理学和药理学特性，电压敏感性钙通道（钙通道）由3个钙通道家族组成，L-型钙电流的通道属于Cav1家族；P/Q-、N-、R-型钙电流的通道属于Cav2家族；T-型钙电流的通道则属于Cav3家族。其中L-型参与一些兴奋-收缩∕分泌偶联和心肌的活动；T-，N-，P-，Q-和R-型参与神经递质的释放。[153-155]
芋螺通过其鱼叉样小毒箭螫刺伤与其接触的裸潜、捕捞人员、游泳者及其他海洋作业人员,造成局部皮肤损伤,毒素吸收后导致全身中毒。误食或吃法不当也可引起全身中毒。尚无有效的治疗方法,一般采用对症疗法和支持疗法。[156]在药理学上，芋螺毒素表现为配体和电压门控的NM-DA受体非竞争性拮抗剂。NMDA受体属于离子型谷氨酸受体亚家族，介导Ca2+跨膜内流，为兴奋性氨基酸受体，由3种亚基组成：NR1、NR2（A-D）和NR3（A-B）。NR1是功能亚基，可单独构成离子通道，NR2和NR3是调节亚基，不能单独构成离子通道，分别增强或抑制NR1亚基的功能。NMDA受体发挥功能至少需要NR1和NR2的表达，NR3不是NM-DA受体发挥功能所必需的。研究发现，Con-G特异性拮抗含NR1/NR2B亚基的NMDA受体，Con-T与Con-R拮抗含有NR1/NR2A/NR2B及NR1/NR2B亚基的NMDA受体，而同种conantokins的不同类似物对NMDA受体的拮抗活性也存在差别。由于NMDA受体的亚基组成在生物发育过程中存在时空特异性以及疾病发生、发展过程中的阶段特异性，因此，芋螺毒素对疾病不同发展阶段和不同部位可能存在不同作用。[157-159]
研究发现，Conantokins4个成员N端前4位氨基酸残基均相同，为分子中的保守序列，足以说明该结构的重要，Con-R与Con-L甚至N端前15位氨基酸均相同。而Con-R对噪声诱导惊厥小鼠的保护指数为17.5，而Con-L的保护指数仅为1.2，表明二者C端序列差异是影响其抗惊厥活性的主要因素。研究发现，Con-R的N端前5位氨基酸残基中任何一个发生改变，多肽的活性都要下降11~1000倍，因此认为Con-R与NMDA受体结合并发生作用的关键序列就是这5个氨基酸残基以及紧随其后的两个转角并与其位于α螺旋同一侧面的其他氨基酸残基。[160-161]研究显示，癫痫病人NMDA受体NR2B亚基的mR-NA较对照组增高，表明NMDA受体NR2B亚基功能上调可能参与癫痫发病，选择性作用于NR2B亚基的Con-G可能具有治疗癫痫的潜力。动物实验显示，Con-G抗大鼠癫痫的半数有效剂量（median effective dose，ED50）在噪声诱发组为3.5 pmol；电击诱发组为25.9 pmol；戊四唑诱发组为28.7pmol；木防已苦毒素诱发组为50 pmol，这表明Con-G对不同原因引起的癫痫都有潜在治疗作用，显示出广谱、高效的抗癫痫活性。与其他NMDA受体非选择性拮抗剂相比，Con-G可剂量依赖性地阻断刺激大鼠角膜激发的癫痫发作。侧脑室单次注射Con-G显示出快速、持久的药效。通过比较，Con-G的作用特点类似广谱抗癫痫药2-丙基戊酸钠。研究还发现，Con-G与其他NMDA受体拮抗剂以及标准抗癫痫药相比，其有效剂量（ED50）与毒性剂量（TD50）跨度更大。此外，Con-R也被证明在4种动物癫痫模型上效果优于艾芬地尔（ifenprodil）和地佐环平（dizocilpine，MK-801），侧脑室微量给药即可阻断噪声诱发小鼠癫痫发作，并可部分阻断癫痫阵挛发作，且该剂量远低于毒性剂量。这表明，Con-G、Con-R在有效治疗剂量范围内不引起毒性作用，安全性比现有抗癫痫药物更好。[162-164]含NR2B亚基的NMDA受体在痛觉信息传递和痛觉敏化的形成过程中扮演重要作用。因此，针对NR2B亚基的NMDA受体拮抗剂conantokins具有对疼痛潜在的治疗作用。有研究表明，给小鼠鞘内注射Con-G和Con-T，均能减轻福尔马林诱导的Ⅱ相痛、坐骨神经结扎后的痛觉过敏和弗氏完全佐剂（Complete freund’sAdjuvant，CFA）导致的诱发痛。另外，它们发挥镇痛作用的剂量和出现副作用的剂量相差20倍以上。这表明，Con-G和Con-T在有效的镇痛剂量范围内几乎无任何副作用，是一种理想的镇痛药物。[165-166]NMDA受体过度激活可以造成胞内Ca2+超载，引发细胞死亡，采用conantokins治疗脑缺血损伤成为新近研究的热点。Williams等采用SD大鼠胚胎脑细胞进行研究发现，Con-G将十字孢碱（staurosporine）诱导的细胞凋亡存活率提高60%，高于艾芬地尔和地佐环平，在此基础上他们发现Con-G能够显著减少大脑中动脉阻塞大鼠脑梗死面积，具有8h的保护期。此外，Con-G不仅能够有效减少中脑动脉阻塞大鼠梗死灶细胞c-fos的基因表达，且能够增加抗凋亡基因bcl-2阳性细胞数并减少损伤区域DNA断裂数量。这表明Con-G具有潜在的神经细胞保护作用，提示其具有抗脑缺血损伤的潜力。[167-168]由于NMDA受体参与精神活性物质奖赏效应的形成，因此conantokins对于精神活性物质成瘾具有潜在干预作用。魏娟娟等观察到Con-G使吗啡依赖小鼠平均跳跃次数减少89%，并呈剂量依赖性，相同剂量Con-G[S16Y]可完全抑制吗啡依赖小鼠戒断跳跃；而Con-R[1-17]仅使吗啡依赖小鼠平均跳跃次数减少40.2% ~58.3%。可见，Con-G和Con-G[S16Y]抗吗啡依赖药效强于Con-R[1-17]，其原因可能是Con-G和Con-G[S16Y]对NMDA受体NR2B亚基的选择性高于Con-R[1-17]。[169-170]Conantokins对帕金森病也显示出一定治疗作用。给帕金森病大鼠注射Con-G进行干预，发现它能够呈剂量依赖性地加强左旋多巴诱导的大鼠旋转。另一项研究表明，Con-G可以增强甲基苯丙胺诱导大鼠的行为学效应。其原因可能是甲基苯丙胺可以促进多巴胺释放，Con-G给药间接增强了多巴胺激动剂的药效。该结果提示，conantokins具有治疗帕金森病的临床应用潜力。[171-172]
芋螺毒素药用研究的其他方向还有：具有去甲肾上腺素转运蛋白抑制作用的T家族芋螺毒素，可用于治疗抑郁症。以及抑制α1-肾上腺素受体的一些芋螺毒素，可用于治疗良性前列腺过度增生引起的尿失禁。[173]
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