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淘豆网网友近日为您收集整理了关于PAF和PAF-AH检测对大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）早孕诊断的可行性研究的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：PAF和PAF-AH检测对大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）早孕诊断的可行性研究 四川农业大学硕士学位论文PAF和PAF-AH检测对大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)早孕诊断的可行性研究姓名:张守信申请学位级别:硕士专业:动物遗传育种与繁殖指导教师:郑鸿培;侯蓉摘要本文建立了定量检测血小板活化因子(Platelet activating factor,PAF)的方法一一血小板凝集生物学检测法,检测了大熊猫配种前后m浆中PAF的含量;采用酶水解底物显色法测定大熊猫配种前后PAF乙酰水解酶(PAFAcetythydrolase,PAF—AH)活性,探讨了大熊猫血浆中PAF与早孕相关性血小板下降的关系,以及定量检测血浆PAF含量、PAF—AH活性应用于大熊猫早孕诊断的可行性。在血小板凝集生物学检测法的建立中发现,薄层层析法纯化PAF的回收率为96’3%。适宜的血小板浓度范围为3.5叫.O×10”/L(此时有较大的聚集率);在小于3.5×109/L时聚集率较低,大于4.O×109/L时聚集率变化大,结果不稳定(来源：淘豆网[/p-.html])。标准PAF诱导洗涤血小板聚集的线性范围为2~lOu∥L。本研究检测了大熊猫配种前后血浆中PAF含量与PAF—AH活性。若以大熊猫尿中雌激素水平陡然下降的当天或者首次能够进行自然交配的当天为0天,在O.2天连续采集大熊猫血浆样品,同时检测大熊猫外周血小板数。根据大熊猫外周血小板数的变化,将受试大熊猫分为外周血小板显著下降组和未显著下降组,研究发现,两组相比0天以后PAF值差异不显著(3.85士0.60 ug/LVS 3.79士0.76 ug/L,P&O.05);根据大熊猫产仔情况将大熊猫分为产仔组和未产仔组,比较后发现,l或2天大熊猫外周血中PAF值差异不显著(3.80+0.78 ng/LVS 3.79士0.76 ug/L,P&O.05)。采用酶水解底物显色法检测大熊猫(n=2)配种前后血浆中的PAF.AH活性后,初步发现d血浆样品中P:AF.AH活性下降f从12.42nm01.minq.ml“下降到10.27nm01.min一.ml~:从13.33nm01.minq.ml“下降(来源：淘豆网[/p-.html])到12.11 nm01.min~.ml“1。以上结果既明:通过检测大熊猫血浆中PAF含量进行大熊猫超早孕渗断,该途径难度较大,建议尝试其它途径继续该项研究。血浆PAF.AH活性可能在早期妊娠中有所变化.需要进一步探讨。关键词: 大熊猫妊娠诊断血小板活化因子(PAF)PAF乙酰水解酶第一部分文献综述1.大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)妊娠诊断的研究进展妊娠诊断是人类在认识动物生殖规律的基础上建立的繁殖技术之一,是提高动物繁殖力的重要技术手段。山于大熊猫配种效果难以准确判断,在实践中,为了使雌兽满配和满怀,人们常常采取对大熊猫多次配种的方法。随着大熊猫繁殖技术的提高,特别是冷冻精液的人工授精的应用,使得人工输精后的早期妊娠诊断成为亟待解决的问题。通过不断努力,人们相继摸索出了一些适合大熊猫的妊娠诊断方法,直至超早期妊娠诊断(受精卵着床前妊娠诊断)的建立和应用。在大熊猫妊娠诊断中,人们最早采用的是观察和分析人工授精后大熊猫行为和生理特征的变化,如出现食欲减退,食性和行为改变以(来源：淘豆网[/p-.html])及乳房膨胀,***红肿等生理变化,以判断大熊猫妊娠与否。但大熊猫发情后的假妊娠与妊娠的临床表现基本相似,容易导致诊断错误,出现“假妊娠”母兽最终空怀,没有分娩。在大熊猫的妊娠诊断上,人们曾借鉴其它动物以及人类上常用的妊娠诊断方法。曾尝试检测大熊猫绒毛膜促性腺激素(cG)类物质进行妊娠诊断(陈玉村;郭伟等,1993;刘维新等,1993)。陈玉村(1990)定期对雌兽的血清和尿液中的大熊猫绒毛膜促性腺激素(Panda Chorionie Gonadotrophin,PCG)的含量进行测定。结果发现血清中的PCG可以在妊娠的第5周测得,尿液中的PCG则要第11周爿’能测得,且PCG含量在妊娠早期和晚期各出现一个高峰,与人类妊娠早期和晚期分别出现的两个HCG高峰相似,但大熊猫CG样物质在妊娠期含量很低。Hodges等(1984)报道了大熊猫妊娠期}}{体激素的变化,Masui等(1985)连续5年测定了大熊猫尿液中的雌激素和孕二醇。但是,这种方法往往要在配种后50d以后刁‘能得到结果(来源：淘豆网[/p-.html]),由于非妊娠大熊猫也出现近似妊娠大熊猫的激素分解产物的峰值变化,不易区分,容易误诊,导致准确率不高。Monfort等(1989)对大熊猫排卵前8周到临产前2周尿液中类固醇激素含量进行了检测,结果显示,妊娠大熊猫尿液中类固醇激素的含量上升较晚,这与大熊猫延迟着床有关(妊娠期83~18ld),并支持了大熊猫为延缓着床动物的观点。检测方法较复杂,检测例数少,不能解决早孕诊断问题。出于大熊猫具有延缓着床的特殊现象,人们从着床前妊娠诊断入手,开展了大熊猫着床前的妊娠诊断研究,对早孕因子(early pregnancy factor,EPF)以及胚源性血小板激活因子(embryo—derived platelet—activating factor,EDPAF)作了大量研究,耿得了一定进展。早孕因子(EPF)是从孕卵着床前到妊娠中期存在于母体血清中的免疫活性调节物质,被认为是与早期妊娠相关的物质。小鼠配种后6h(小时)即可发现多种免疫抑制性早孕因子,母牛在受精后24~48h可检测出血清中的EPF。因此,(来源：淘豆网[/p-.html])通过检测EPF是否存在,可以达到确定妊娠的目的。刘维新等()采用E.玫瑰花环形成试验进行了探索,根据母体外周血中T淋巴细胞的E.玫瑰花环结合率的变化诊断大熊猫妊娠。试验结果发现,妊娠母兽在配种后96.144 h T淋巴细胞的E一玫瑰花环结合率有明显下降,而未妊娠则不明显,能够较准确地诊断大熊猫妊娠。但是出于两方面的原因,通过检测EPF进行妊娠诊断受到了很大的限制。一方面,由于EPF的分子非均一性,随物种不同和孕期不同其分子量存在差异;另一方面,检测EPF活性的办法到目前为止仍沿用经典的玫瑰花抑制实验,而浚方法程序繁琐,工作量大,流程长,条件难以控制和实验干扰因素较多。胚源性血小扳活化因子(EDPAF)作为着床前早期胚胎产生的一种自身调节因子,在受精后6h即可测出。已在小鼠、羊、人胚和大熊猫等证实有EDPAF活性表达,因此,检测配种后雌兽血清中有无EDPAF活性表达能判断早期胚胎的有无。龚亚奇等()采用无脾小鼠生物检测法,对8例次人工授精前后的大熊猫血液检测(来源：淘豆网[/p-.html]),发现3例取血时间适当的妊娠大熊猫血清均引起受体小鼠血小板数下降,而受精前对照大熊猫血清或l临床未证实妊娠的大熊猫血清对受体血小板数无明显影响,说明早孕大熊猫血清内有EDPAF活性表达。该结果在侯蓉(2002,未报道)研究中进一步证实。O’Neill(1985)发现,在小鼠早孕期问外周血小板计数明显减少。这种现象可能是母体对妊娠的最初全身性反应,受精后3h,血小板计数开始显著下降,在9h内降低到最低水平。早孕相关性血小板减少可能是由于胚胎产生的血小板活化因子(PAF)所致。因此,根据血小板是否显著减少就可在配种后数小时至数天内就做出受精检查及超早期妊娠诊断。基于妊娠早期母体疯小扳减少的情况,侯蓉等(2002)对大熊猫外周血小板计数,探讨EDPAF定性检测,以此判断妊娠,结果阳性的准确率为85.71%(6/7),阴性的准确率为100%(6/6)。但该方法的一个最大缺点在于受采集血样时叫和次数的限制。采用该方法检测,需要采集0 d(天)、ld或2d血样(以大熊猫尿中雌激素陡然下降的当同或者以首次(来源：淘豆网[/p-.html])能够进行自然交配的当日作为Od);如果缺少上述血样,将无法对结果进行判断。出于采集血样需在麻醉条件下进行,仅仅在人工授精时方能采集到血样,同时大熊猫体况较差或受伤等因素也干扰血样的采集,因此常常不能采集到所需血样。因此,建立一种定量检测PAF的方法探讨血浆中PAF含量与早孕相关性血小板下降的相关性,以及与早期妊娠的关系,有利于扩大生产应用的范围,也有利于评估大熊猫早期胚胎在体内的质量(存在与不存在),弄清大熊猫胚胎延迟着床的时间,探讨大熊猫不孕不育,分析具有征常繁殖能力的大熊猫配种后未能产仔的原因。同时部分文献已经显示妊娠与未妊娠动物血浆中PAF乙酰水解酶(PAFAcetylhydrolase,PAF-AH)活性存在变化;在妊娠的不同阶段血浆中PAF.AH活性也有所不同(见本文“PAF-AH与妊娠”)。本研究检测了配种前后大熊猫血浆中PAF-AH活性,初步分析了PAF-AH活性与早期妊娠的关系。2.血小板活化因子(PAF)与生殖2.1 PAF的生物学特性血小板活化因子是磷脂介质,其化学结构是(来源：淘豆网[/p-.html])1.氧.烷基.2.乙酰基.sn.甘油一3.磷酸胆碱(1-O—alkyl一2一acetyl-sn—glycero-3-phosphocholine,Sn代表甘油骨架),化学结构缩写AGEPC(acetyl glyceryl etherphosphocryl choline),分子量为1100,因在甘油骨架l位和2位上分别有醚键和乙酰键,故又有PAF.酰醚(PAF.acether)之称。CH—CH——(cH2)15——CH3og——cH。H20H2I自l(CH3)8酗1 PAF的分子式1979年Demopoulos对PAF进行了鉴定和合成。体内PAF在其Sn-1位含有不同的烷基和双键结构,95%为(16:0)或(1 8:O),称为CJ6PAF和ClgPAF,前者生物学活性较强。sn-2位的乙酰基对PAF的生物学活性起决定作用。PAF有右旋、左旋两C~o。k0种异构体,但只有天然形成的左旋体具有生物学活性。PAF在体内的合成途径包括两条酶促途径:修饰途径(remodelingpathway)和新生(来源：淘豆网[/p-.html])途径(denovepathway)。修饰途径是病理条件下合成PAF的主要途径(图2a)。新生途径则是生理条件下合成PAF的主要途径(图2b),它的合成前体底物为烷基甘油磷酯,此过程不可逆,亦不伴花生四烯酸(AA)的产生。已经发现PAF在多利t组织中存在,包括脑、。肾小球、肝、胃、子宫、卵巢。C108. {『抛l-。。』抛C———●u1一u3一,coR: 目一』二一。‰。g—C———Hp u_1ju,L。coR, f}c08~I—二+吼甚~}L洲 L虻№p^F幽2(a)新生途径 1.烷基甘油磷酸乙酰转移酶;2.磷酸水解酶:3.磷酸胆碱转移酶㈨。,且Fl m』∑c甚joR㈨4)热i丢m_{三出t一。C—PCho 。毗“”。…一幽2(b)修饰合成1膦脂酶A2(PLA2)或CoA-非依赖性转酰基酶;2.LySO.PAF乙酰转移酶PAF在体内代谢较快,其在血液中的半衰期仅为30秒,不久即失活。参与PAF降解的酶中,较主要的酶有5个:PAF乙酰水解酶(PAF.acetylhydrolase,PAF.AH(来源：淘豆网[/p-.html]));酰基移酶(polyenoatetransacylase);酰基裂解酶(tetrohydropteridine)磷脂酶D(PLD);磷脂酶C(PLC)或称磷酸水解酶。在上述酶的作用下PAF逐步降解为LySO.PAF、烷酰基磷酸胆碱、磷酸胆碱、磷酸甘油和胆碱,最终生成磷酸和甘油。其中PAF—AH是PAF的主要降解酶,能脱掉Sn.2位的乙酰基而形成无生物活性的LySO.PAF。PAF的代谢调节受诸多因素的影响,凡影响代谢过程中关键活性或(和)底物合成的因素均可影响PAF合成。这些因素主要有:(1)Ca2+对PAF的重要调控作用。ca”可提高LySO—PAF乙酰基转移酶的活性,促进病理条件下PAF的合成,亦可直接抑制PLD对PAF的降解,使PAF维持较高水平;另一方面,Ca2+还能抑制新生途径中PAF合成所需的三种酶(乙酰转移酶、磷酸水解酶、磷酸胆碱转移酶)的活性,减少生理途径中PAF的合成。(2)PAF.AH的调控作用。血浆中的PAF-AH主要是由巨噬细胞和肝细胞合成分泌的,其细胞内外形式均可催化相同底物。(3)其它炎症介质。花生四烯酸可通过提高合成酶活性或抑制降解酶活性,使PAF维持较高水平,从而协同放大PAF生物学活性,这在修饰途径中表现更为突出。2.2 PAF的生物学活性PAF生物学效应非常广泛:PAF在nmol/L水平就能引起大鼠、兔、人血小板的强烈聚集,促进血小板释放反应:刺激多形核白细胞聚集、趋化、黏附等;刺激单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞活化,促进细胞因子的产生;促进平滑肌细胞的增殖;参与血管通透性升高、血栓形成、低血压、肺动脉高压、门脉高压、过敏反应、心脑血管微循环障碍、胃肠粘膜损害等一系列相关疾病的发生发展过程。生理状态下,体内PAF主要参与细胞内信息传递和代谢调节,与生殖有关。PAF的生物学作用有以下特征:有饱和性和可逆性;PAF与靶细胞有特殊结合位点,且只有天然的R构型,PAF能作用于靶细胞使其发生反应:作用浓度低(通常低于O.1mmol/L);组织暴露于PAF后即能发生特异的脱敏作用;PAF拈抗剂有特异抑制作用。这些也都说明PAF是通过靶细胞膜上特异的PAF受体发挥作用的。用[3H·PAF]或PAF受体拮抗剂[3H]WEB2 086进行配体试验表明,在人和动物许多组织、细胞表面存在PAF受体。目前有关PAF受体亚型的种类、分子结构及特性尚未明确。PAF拮抗剂抑制精子活动和受精,PAF抗体可抑制胚胎发育,而且PAF拮抗剂也能抑制植入,这些都显示出PAF在胚胎方面的作用可被受体介导。Roudebush等研究证明了小鼠植入前胚胎(2.细胞)存在PAF受体。PAF发挥其生物学活性是通过与细胞、组织中的PAF受体结合而实现的。PAF受体除在多种组织和细胞中存在以外,在生殖道,家兔的输卵管内膜和子宫内膜(Yang YQ,1992;Kudolo GB等,1995),人的子宫内膜和子宫肌层都有PAF受体分布(Ahmed A等,1994)。受体结合分析结果表明,人子宫肌层PAF受体的最大结合位点位为94.3土25.8mol/mg蛋白,其平衡解离常数为O.27士0.05nmol/L。通过放射自显影法观察3H—PAF在妊娠家兔的胚胎植入前与子宫内膜结合的部位,表明PAF多与内膜腺上皮细胞结合,不与问质细胞和肌细胞结合,胚胎植入部位的PAF结合量达到最大。1994年Ahmed等利用反转录PCR技术从人子宫内膜上皮细胞系HEC-113细胞内扩增出PAF受体的特征mRNA序列,证实子宫内膜上皮细胞存在功6能性PAF受体。在兔子宫内膜上存在PAF的特异性结合位点。在发情、妊娠第2d和假孕第6d时,这种结合位点具有较高亲合力。通过饱和分析法可测得其亲合系数(kd)为O.8nM,结合力为377fmol/mg蛋白质。如果用较粗糙的膜制剂分析,可发现还有一种低亲合系数的结合位点。PAF主要通过与质膜受体结合来发挥作用。PAF受体是G蛋白偶联的质膜受体超家族成员之一,拥有7个跨膜结域、一个胞外结合配体的结构域和~个胞内结合效应物的结构域。有关PAF受体介导的细胞内信息转导机制,目前尚未完全清楚。其可能机制为:由偶联蛋白(G蛋白)、磷脂酶C(PLC)或腺苷酸坏化酶(AC)在PL或其它细胞、组织中构成PAF受体“专一转导蛋白”,通过活化G蛋白,激活磷脂肌醇特异性的PLC,或抑制腺苷酸环化酶,催化质膜磷脂肌醇水解,产生两个细胞内信使——二酰甘油(DG)和三磷酸肌醇(IP3)。IP3诱导细胞内的ca2+浓度升高,DG则激活蛋白激酶C。前者通过激活PKC,使其对Ca”和磷脂亲和性增加,进而刺激蛋白底物磷酸化,引起特定效应。后者使ca2+从细胞内钙池中释放,引起ca2+浓度升高。蛋白激酶A和蛋白激酶C可以在高Ca2+浓度下使一些蛋白质的丝氨酸和或苏氨酸残基磷酸化,进而发挥特定的生理生化功能。有丝分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)在PAF的信号传导通路中起十分重要的作用。PAF以剂量和时问依赖性的方式诱导一些MAPK的酪氨酸残基磷酸化。蛋白激酶A、蛋白激酶C或酪氨酸蛋白激酶的抑制物预先与精子单独孵育可以使PAF诱导的顶体反应显著降低但不能完全抑制,当用三种抑制物共同处理则完全抑制PAF诱导的顶体反应。这些结果表明,蛋白激酶A、蛋白激酶c和酪氨酸蛋白激酶信号通路可能参与了PAF的信号传递,而且这些信号通路之间的相互作用可能调节PAF的作用效果。2.3 PAF在生殖方面的研究免疫学研究的进展使人们把免疫机能与妊娠联系起来。Medawar(1953)提出“母体免疫机能在妊娠期间相应降低”的观点。Morton等(1979)对羊进行的早;lJj妊娠试验及Koch等(1983)的研究都说明早期妊娠因子生物学可以应用于早期妊娠诊断。研究表明。着床前的早期胚胎产生的胚源性血小板激活因子(EDPAF)刺激母体产生EPF(C.Orozeo等,1986;EM.Clarke等,1990)。最早认识到血小板激活因子可能参与生殖过程是由于BiI[ah和Johnston于1983年观察到PAF出现于分娩期孕妇的羊水中,接着又证实子宫肌对PAF标准品的收缩反应类似于羊水中PAF样物质引起的收缩反应,从而认为PAF在分娩过程中起作用。1985年O’Neill等发现雌小鼠在交配后,自妊娠当R起,外周血小板数明显下降,下降l蝠度为20—30%,假孕鼠却未发生此现象。妊娠小鼠与非妊娠小鼠之间血小板计数的差异具有显著性。这一差异持续到交配后第7d后消失。而将2.细胞期体外受精胚胎移植到假孕鼠后,能够产生血小板减少现象。他认为这种血小板数量的变化是因为受精卵的存在,是母体在受精卵植入前的最初反应,并推测这种早孕相关性觑小板减少是受精卵释放了某种类似于PAF的物质所致。进一步研究发现,体外胚胎培养液中含有PAF类似物。将8.和16.细胞期胚胎培养液的上清液注入去脾雌鼠腹腔,10分钟后血小板数显著下降;注射培养原液或未受精卵培养液,则不改变血小板计数。再将胚胎培养液进行薄层分析,结果证实受精卵产生的PAF类似物的化学和生理特性均与人工合成的PAF相似(SnydeLl985)。而未受精的卵细胞培养液中未发现有PAF存在。这在以后的实验中得到了证实(Cellier等,1988;Ryan等,1989)。妊娠期PAF具有多种生理性来源,除了早期胚胎,血液中的PAF可以白蛋白和高密度脂蛋白(HDL)为载体透过血液.卵泡屏障及输卵管内膜进入卵泡液和输卵管中(Lepage N等,1993),精子、子宫内膜、胎膜以及胎儿均能产生PAF。PAF与许多生殖过程有关,包括受精、植入和分娩。2.3.1 PAF在雄性生殖方面的作用1987年Kumar等人用HPLC(高压液相色谱)和TCL(薄层层析)法分别测定兔的精子和精清中的PAF活性,结果发现兔精子含有PAF,其含量为0.35j:0.06pmol/106个精子,没有在精清中发现PAF。用能活动但不成熟的精子来测定,未检测出PAF活性。试验提示精子可产生PAF,而精子的成熟与PAF的合成之间有一定的联系。之后,大量的研究发现,PAF在雄性生蒴方面至少有下列作用:促迸体外获能,增加精子活力和运动速度:提高精子的顶体反应率;提高受精率;参与精子对透明带的穿透。2.3.2 PAF在雌性生殖方面的作用2.3.2.1 PAF与丘脑下部一垂体轴Junier等发现在大鼠组织培养液中,极低浓度的PAF.酰醚(1×10“4M)便能抑制促性腺激素释放激素(GnRH)和生长素抑制因子(Somatostmin)从『F中隆起(ME)的释放,而对生长素释放因子(GRF)的释放却无效。此外,PAF还抑制钙离子对丘脑下部神经肽释放的刺激作用,而对垂体前叶促黄体素(LH)和生长素(GH)的释放缺乏明显的直接作用。向散布的大鼠垂体前叶细胞中加入1-lOOnM的PAF,lmin后促乳素的释放呈现剂量依赖性的增加,这种变化可持续2h,但这种变化又可被PAF拮抗剂所抑制。而lyso.PAF却不能刺激促乳素的分泌和释放。PAF似乎参与了丘脑下部一垂体轴对激素分泌活动的调节。2.3.2.2 PAF与排卵PAF在卵泡的发育和排卵过程中起重要作用。PAF可引起卵泡周围的血管内皮细胞收缩,使细胞间缝隙加大,从而增加血管通透性,有利于卵泡液的聚集。同时PAF激活血小板,使之释放多种活性成分,包括舒血管多肽、ADP、血小板因子Iv、B.血栓球蛋白和血小板生长因子,这些物质均参与了排卵过程。试验表明,向经过HCG处理的未成熟大鼠卵巢囊中灌注PAF拮抗剂BN52021,可抑制卵泡的破裂,而且由HCG诱导的胶原细胞融解和j衄管渗透性也减弱。但是BN52021的这种作用又可被PAF一酰醚的处理所逆转。此外,大鼠在注射HCG超排后,卵巢PAF的含量减少。PAF可能参与排卵过程的调节,且可能是触发排卵的一种额外启动。Velasquez发现,PAF的拮抗剂TCV-309和BN一52021能明显地延缓动物的卵子运输到子宫的过程,而发情周期中的动物却无此特点。对发情期的仓鼠施用队F可加快输卵管内卵子的运输过程。研究发现在兔输卵管中有两个部位存在着PAF受体。2.3.2.3子宫PAF的分泌及其对妊娠的影响文献报道能够在兔(AngleMJ,1988)和大鼠(YasudaK,1986;Li L,1999)子宫中、培养的人子宫内膜细胞内(AlecozayAA,1989)、移植的绵羊子宫内膜组织中(BattyeKM,1996)检测到PAF的存在。将沙袋鼠的子宫内膜体外培养,分泌PAF,在不同黄体阶段PAF分泌水平不同。PAF在妊娠阶段的母体识别中具有重要的作用,它促进人(AlecozayAA,1991;Smith SK,1988)、绵羊(Salamonsen LA,1991)、牛(TiemannU,1995)子宫内膜前列腺素E2的合成。发情时大鼠子宫内PAF可达含量可达到21ng/Zj2宫(相当于81pm01),而发情兔子宫PAF含量只有2pmol/g。假孕兔和孕兔从妊娠第3d起子宫PAF开始增加,在妊9播放器加载中，请稍候...
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