我国甘蔗组织培养工厂化育苗技术的应用与展望--《甘蔗糖业》1989年05期
我国甘蔗组织培养工厂化育苗技术的应用与展望
【摘要】：我国甘蔗组织培养工厂化育苗快速繁殖研究开始于70年代中期,在世界上首先大田实际应用几十万亩。研究大体经历了愈伤组织成苗,胚性细胞团成苗,芽器官液培成苗三个阶段。组培后代蔗糖分阶段性降低,移栽及育苗效率低,成本高是本研究的三大薄弱环节,应重点开展攻关。今后的目标应是研制甘蔗人工种子及建立高效率的蔗苗工业化完整生产体系。
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【关键词】：
【正文快照】：
一、引言 甘蔗是以蔗茎芽进行营养繁殖的作物,目前平均亩产在3~5吨左右,而每新植一亩甘蔗就需种茎200一400公斤,不仅造成产量损失,而且繁殖系数也很低,一般一年仅十几至几十倍,大面积推广一个良种常常需十年左右的时间,给新品种的推广造成很大困难。所以人们从几十年前起就开
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【引证文献】
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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&&&&&&&一、引言　　植物组织培养是在19世纪细胞学说的基础上，于20世纪初期初步获得成功的。此后，在植物细胞全能性学说的推动下，植物组织培养技术得到了迅猛的发展，在理论和应用方面都取得了很大的进展。组织培养技术已不仅是生物科学研究的一种极为有用的手段和方法，而且已逐步走向产业化应用的道路，加速和推动了农业生产和生物制药等各个领域的技术革命。　　随着我国市场经济的进一步发展和人民生活水平的不断提高，果树、蔬菜和花卉等经济作物在农业生产中所占比重也日趋增长，对各类苗木的数量、质量和纯度的要求也越来越高，一般常规的苗木繁殖技术已难以保证大规模迅速发展的需求。于是应用现代高新技术——植物组织培养快速繁育优良品种的无性系苗木和应用生物技术培育新品系、新品种，创建有自主知识产权的新产品，便有了无限广阔的应用前景，既有深远的社会效益，更有直接的经济效益。　　二、植物组织培养基本概念　　利用植物体的器官、组织或细胞乃至原生质体，通过无菌操作后接种在人工配制的培养基上，在适宜的光照和温度条件下进行培养，使之分化、生长、发育的技术统称为植物组织培养。由于培养物是脱离了植物母体，在试管或其他容器中进行培养，所以也叫离体培养。　　（一）植物组织培养常用术语解释　　1．外植体&&由植物（母体）上取来用作离体培养的材料被称为外植体。　　2．初始培养&&最初接种在培养基上的外植体的培养为初始培养。　　3．继代培养&&将获得的增殖的培养体（芽、茎段或带愈伤组织的丛芽团块等）移植到新鲜的培养基上再次或反复多次的切割移植培养。称为继代培养。　　4．继代周期&&前后二次继代培养的间隔时间（天数）称为继代周期。　　5．增殖系数&&后一次培养物（芽或团块）的数量比前一次培养物增加的倍数称为增殖系数。譬如，一个芽（或小团块）经过一个月培养后长成丛芽，经过切割分离成7个芽（或小团块）转移到新鲜培养基上进行继代培养，那么它的增殖系数即为7，继代周期为一个月（30天）。　　脱分化&&如果初始接种在培养基上的外植体，不是通过芽原基萌发的途径直接生长，而是首先形成愈伤组织，再行分化为不定芽或无性胚时，这种初始培养被称为脱分化，所用的培养基被称为脱分化培养基。　　7．分化培养&&经过脱分化阶段的外植体（形成愈伤组织，或肉眼看不到愈伤组织），转移到另一培养基上分化出芽（或小球茎）或胚时，则称为分化培养，所用的培养基也就称为分化培养基。　　8．增殖培养&&已分化芽、小球茎（芽丛或小球茎团常称为团块）和无性幼胚再继续进行增殖，即为增殖培养，所用的培养基则为增殖培养基。　　9．生根培养&&诱导生根形成完整植株，就是生根培养，所得到的完整小植株便称组培苗。　　（二）植物组织培养技术分类　　1．按外植体来源分类　　（1）胚胎培养&&外植体为胚、胚乳、胚株、珠心或子房等，以及在试管中进行试管受精等。　　（2）花粉培养&&外殖体为花药或直接取花粉粒进行培养，其主要目的是诱导形成单倍体植株。　　（3）器官培养&&取植物体的根、茎、芽、叶、花、果等器官或其部分组织进行培养。　　（4）愈伤组织培养&&从植物上任一部分取来的离体材料，通过激素等诱导形成愈伤组织来进行培养。愈伤组织的生长没有明显的极性，只有内外的生长陡度，一般是外围的细胞分裂和生长比内部的快，能长期继代培养而不衰退，可以连续继代扩增愈伤组织，或通过愈伤组织诱导产生不定芽或无性胚等。　　（5）细胞培养&&通过机械或化学的方法，将植物细胞分散成单细胞，进行细胞悬浮培养或单个细胞的培养，建立细胞无性系。　　（6）原生质体培养&&通过酶解等方法将细胞除去细胞壁后，用分离获得的原生质体来进行培养。培养的原生质体可通过细胞融合获得种间杂种或新品种。原生质体也是遗传操作的良好受体材料。　　2．按应用目的分类　　（1）无性系的增殖扩繁&&利用植物体的器官或某一部分组织的细胞进行无性增殖。如在植物组织培养快速育苗中，主要应用营养器官如芽或顶端分生组织、鳞茎等进行培养，这样培养获得的营养系后代相对变异最小，可以保持原品种的品种特性，进行所谓工厂化育苗繁殖各种优良品种或优良单系。无性系的增殖扩繁尤其是悬浮培养的细胞无性系也可用于提炼生产各种药物、调味品等生物制品。在培养过程中通过对培养基和培养条件的调节，常可提高所需有效成分的含量而提高生物制品的产量。　　（2）获取无病毒苗&&在试管内利用微茎尖（＜0.1～0.2毫米）培养，并结合应用热处理等技术，可以脱除植物的多种病毒，获得无病毒的种苗。　　（3）杂交育种&&在试管内无菌培养条件下进行人工授精，或利用原生质体融合获得杂种细胞并进行培养。常用于育种研究和获得杂种后，培育新品种（系），有利于克服远缘杂交不亲和的难题从而创造新物种。　　（4）人工诱变筛选育种&&在组织培养过程中，结合各种人工诱变技术，如染色体加倍、辐射诱变、化学诱变等，对诱变的细胞或组织进行培养诱导和筛选。常用于人工诱变育种。　　（5）植物外源基因导入&&将外源目的基因的DNA片段通过高压基因枪或农杆菌的质粒DNA栽体导入目标植物的外植体细胞或原生质体，并进行再生诱导和筛选培养。常用于生物工程育种，能有目的地改良植物的某种性状。　　三、组织培养技术的应用　　近年来，随着组织培养技术的不断发展，该技术已成为生物科学研究的重要手段之一，对植物生理、生化、病理、细胞分化、细胞器功能、染色体遗传、基因标记定位、基因工程、细胞融合等诸多方面的研究都起到了推动作用。在种质资源的保存和交换、育种和快速繁殖无性系及进行药物生产等方面也已获得了广泛的实际应用效果。　　（一）种质资源的保存与交换　　试管内保存植物种质资源材料，特别是保存无性系材料可以大大地节省土地、人力、物力和财力。而且，便于种质资源材料的远距离之间的交换，可以有效地避免病虫害的人为传播。保存的方法，一般按保存的时间可以分为二种。一种是在培养基中添加某种生长抑制剂，如多交唑等，在一定的低温条件下可以保存数月或1年才继代培养一次；另一种则是利用液氮冰冻保存，可以保存数年。　　（二）组织培养育种　　1．胚培养&&离体胚的培养是组织培养中最早获得成功的器官培养物，它对克服远缘杂交和一些特早熟或无籽果育种中的种子败育等问题的解决有着极重要的意义。如上海农科院园艺所的庄恩及等，利用桃的胚培养技术克服了杂种胚败育的问题，成功地培育出了特早熟的“春蕾”等桃的新品种。在无籽葡萄的育种工程中，也正在研究其杂种幼胚的培养，以期获得无籽葡萄新品种。　　2．胚乳培养&&利用胚乳培养是获得三倍体无籽果实的重要途径，目前在苹果、柑橘、梨、枣、猕猴桃、枇杷等许多重要果树上都已能获得胚乳培养的植株。通过胚乳培养获得的三倍体再经过染色体加倍可望获得六倍体等多倍体植株。一般来说，多倍体植株生长旺盛，果实大，这在育种上同样也具有重要意义。因此，胚乳培养的育种研究常成为果树育种家们颇感兴趣的课题。　　3．花药培养&&利用花药培养诱导花粉形成单倍体植株，不仅可以迅速获得纯系材料，更便于对隐性突变的分离。目前已有上百种以上的植物花药培养获得了成功，有些作物已利用花粉单倍体育出了新品种应用于生产。如1974年中科院植物所与中国农科院烟草所合作，通过单倍体育种方法，仅仅用了三年的时间就育成了烟草新品种“单育一号”，在生产上大面积使用，比常规育种大大地缩短了育种年限。　　4．胚珠培养&&利用胚珠培养也有可能获得单倍体植株。利用胚珠培养结合试管内受精的方法，再与胚培养技术结合起来，有可能在育种工作中克服杂交不亲和等障碍而获得远缘杂交的成功。例如龟谷和日向（1970年）曾用芸苔属植物进行实验，用胚珠培养进行试管内受精，得到了（栽培品种“雪菜”）×白菜（栽培品种“马纳”）杂种植物。　　5．原生质体培养&&利用原生质体培养筛选突变细胞无性系，进而进行细胞融合，有利于克服远缘杂交不亲和的困难，获得远缘杂种新类型。此外，由于原生质体有胞饮现象，它可以摄取生物大分子（如蛋白质、核酸、病毒、噬菌体等）和细胞器（如核、叶绿体、线粒体等），因此，可以进行外源遗传物质的引入，产生遗传上经修饰的细胞。对开辟新的育种途径和遗传工程研究方面有着巨大潜力。　　6．诱变与筛选&&借助细胞、组织培养（包括愈伤组织培养）进行诱变育种，可以提高诱变效果。如重松（1975年）用秋海棠叶片在White培养基上再生出长约0.5毫米的不定芽时用γ射线处理，得到了银白色斑点叶的变异株。利用组织培养技术常常更便于有目的地筛选突变株系。特别是对抗性（抗盐、抗病等）株系的分离和筛选。这也是极有发展前途的育种途径之一。　　（三）组织培养工厂化育苗　　1．快速繁殖&&应用组织培养技术，在一定的控制条件下加速繁殖无性系，繁殖速度远比常规的嫁接、扦插、压条分株繁殖要快得多。一个芽每年可以数百万倍的速度繁殖其后代。最早应用组织培养法进行快速繁殖的是兰花，用一个兰花外植体，一年可以繁殖400万个原球茎。又如一个草莓芽一年内可繁殖108个芽，一个苹果芽在8个月内可繁殖6万条苹果幼茎等等。这对加速繁殖珍稀树种、品种、优系或芽变株系极为有用。目前已有不少果树、蔬菜、花卉等经济作物逐步采用组织培养技术，利用具有规模生产条件的试管苗生产线进行大规模的工厂化生产。　　2．生产无毒苗&&组织培养育苗对培养和生产无病毒苗更具有特殊意义和应用价值。如马铃薯及多种花卉的退化，以及果树的早衰、减产和失去商品价值等常与病毒危害有关。通过热处理和利用微茎尖（0.1～0.2毫米）分生组织培养常可有效地脱除病毒，获得“无病毒”母株，再通过茎尖组织培养即可以加速无病毒苗的繁殖。因此，通过组织培养技术培育无病毒苗在生产上已广泛地应用，取得了良好的效果，这对尽快实现无病毒栽培起到了极大的推动作用。当然，所谓无病毒苗并非绝对的无病毒，现时的无病毒苗只是指不带有本地区规定检疫范围内的危害性病毒（包括非潜隐性病毒、潜隐性病毒、类病毒等）。　　3．生产人工种子&&目前所谓的组织培养工厂化育苗多半是利用茎尖组织培养，或通过茎段、叶等组织再生不定芽（或无性胚）进行繁殖。但是，随着人工种子研究的不断深入和发展，不久的将来也有可能发展到进行人工种子的工厂化生产。芹菜、胡萝卜、莴苣、花椰菜、石斛等作物都曾制成人工种子，有些（在美国）已步入商品化。目前人工种子生产中存在和亟待研究解决的最大的问题是要求存放的条件严格，且不能存放太长时间。　　（四）植物性药物及生物制品的生产　　通过组织和细胞培养进行药物及生物制品生产、涉及的种类日益增多，下表列举了植物组织培养中可能获得的代谢副产物。有些产物在培养物中有效成分的含量已接近或超过天然植株的水平。如利用烟草根尖细胞悬浮培养，可生产2.9%（干重计）的尼古丁；在薯蓣愈伤组织的细胞悬浮培养中可产生1%～1.6%（干重）的薯蓣皂苷素；在烟草细胞培养中，每克（干重）快速生长的烟草细胞可产生360微克的辅酶Q，这是在所有活细胞中发现的最高含量水平。辅酶Q被用作治疗某些心脏病的药物；此外，日本的进志等人在烟草细胞中发现一种新的磷酸二酯酶并制成商品，用作研究m-RN的生化试剂；又如，近年来不少研究红豆杉的组织和细胞培养时，提取出一种抗癌药物——紫杉醇。实验证明，当在培养基中添加一些芳香化合物如苯甲酸、苯丙氨酸和N-苯酰甘氨酸等可有效地提高紫杉醇的产量。除提取药物外，有人从葡萄中提取出一种带有水果香味的萜类化合物，这种化合物的化学合成往往很困难或很不经济，但它可以用葡萄细胞培养的方法获得。随着组织、细胞培养技术的发展和研究工作的不断深入，将会有更多种类的植物性药物和天然调味品、芳香物以及杀虫剂和除草剂等实验组培工厂化生产。　　表&&植物组培产生的代谢产物　　代&谢副产物名称　　生物碱 &&&&&&&&&&&&&&&&&挥发油　　变应原 &&&&&&&&&&乙烯 &&&&&&&&&麻醉剂　　氨基酸 &&&&&&&&&类黄酮 &&&&&&&&&有机酸　　蒽酮 &&&&&&&&&调味料 &&&&&&&&&缩氨酸（肽）　　抗白血病剂&&&&&&&&&&呋喃色酮&&&&&&&&&&香料　　抗菌剂 &&&&&&&呋喃香豆素&&&&&&&&&酚类　　抗肿瘤剂 &&&&&植物生长调节剂&&&&&&&色素　　苯甲酸衍生物 &&激素 &&&&&&&&&&多糖　　苯基吡喃酮&&&&&&&&免疫化学因子& &蛋白质　　苯醌 &&&&&&&&杀虫药剂&&&&&&&类固醇、固醇　　生物转化素&&&&&&&&类胰岛素成分&&&&&&皂角苷、皂角　　碳水化合物&&&&&&&&&&&&胶乳&&&&&&&&&&&&&糖　　强心苷 &&&&&&&类脂化合物&&&&&&&&甜味剂　　苯基苯乙烯酮&&&&&&药物复合物&&&&&&&&&&单宁　　二蒽酮 &&&&&&&&&&萘醌 &&&&&&&&萜烯、类萜　　食品乳化剂&&&&&&核酸及其衍生物&&&&&&植物病毒抑制剂　　酶（同功酶） &&&油&&&&&&&&&&&&维生素　　摘自周美瑛（1988）“中国农学通报”，1988,(5):P42　　（五）遗传工程及其他研究应用　　目前遗传工程的研究内容可以分为细胞水平和分子水平的研究。细胞水平的研究包括细胞杂交、细胞器移植、染色体工程、突变系筛选、病毒和微生物的吸收等等；分子水平的研究包括带有遗传信息分子的吸收，通过不同基因载体（噬菌体或细菌的质粒等）把不同来源的基因引入植物细胞中，获得转基因植物等等。几乎所有的遗传工程的研究最终都离不开应用组织（细胞）培养技术和方法。　　应用组织培养方法，在人工控制条件下更有利于研究植物组织、器官、生长发育规律，细胞与组织的分化，器官的形态建成，生理代谢活动和生物合成途径等等。组织培养技术已在生物学的各个方面得到了广泛的应用，对生理学、遗传学、病理学和分子生物学等各方面的研究都起到了推动和促进作用。　　总之，随着科学技术的发展，组织培养技术的应用范围将日趋广泛，并渗透到农业、医药业、食品工业等和人民生活的各个领域中，加速推动这些事业的发展。
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3秒自动关闭窗口　　2.1　植物细胞工程
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一、教学目标
1. 简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。
2. 列举植物细胞工程的实际应用。
3. 尝试进行植物组织培养。
二、教学重点和难点
1.教学重点
（1） 植物组织培养的原理和过程。
（2） 植物体细胞杂交的原理。
（3） 植物细胞工程应用的实例。
2.教学难点
植物组织培养的实验。
三、教学策略
本节教材内容对学生来说，虽说在必修模块中学了一些细胞的知识，但仍然是一个新的领域，学习起来有一定的困难。教师可采用讲授为主结合讨论的方法进行教学。具体建议如下。
在细胞的全能性及细胞分化的实质、植物组织培养技术这部分内容的教学中，首先可用教材上的菊花图引入本节的标题，同时提出一个问题──为什么植物的一个花瓣就可以培育出完整的植株呢？以引入本节课的第一个问题──细胞的全能性及分化。关于细胞的全能性和细胞分化这部分内容，因为学生在必修模块中学过，所以可以提问的方式让学生回顾，教师再根据学生的回答情况按教材上的内容进行讲解。然后再通过“怎样把植物的一个花瓣培育成完整的植株”这个问题引入本节课的重点及难点问题──植物组织培养技术。教材这部分的内容是通过实验“胡萝卜的组织培养”来进行讨论和总结的，应当尽量创造条件完成这个实验。在不具备完成该实验条件的学校，可以带领学生参观组培实验室，或让学生观看植物组织培养技术的录像片。同时结合教材的讨论题进行教学，还可再补充两个问题：
（1）离体的器官、组织或细胞如果不进行脱分化处理，能否培养成完整植物体？
（2）决定植物细胞脱分化、再分化的关键因素是什么？
在植物体细胞杂交技术及植物繁殖的新途径的教学中，首先可通过教材上的番茄―马铃薯实例引入，让学生思考20世纪60年代，一些科学家提出这样一个设想：让番茄与马铃薯杂交，培育出地上结番茄果实，地下结马铃薯块茎的植物。如果要实现这一设想，你认为可以采用哪些方法？这样一来一下子就把学生吸引到本节课要解决的问题──植物体细胞杂交技术上。随后让学生分析植物体细胞杂交技术的概念，再根据此概念，结合学生原有的植物细胞结构特点、酶的特性及新学习的植物组织培养技术的知识来回答下述问题：
（1）要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起，遇到的第一个障碍是什么？
（2）有没有一种温和的去细胞壁的方法？
（3）如果两个来源不同的原生质体发生融合形成了杂种细胞，下一步该对此细胞做何种处理？
（4）如何将杂种细胞培育成杂种植株？与学生一起讨论后，再按教材上的植物体细胞杂交技术流程图进行总结，重点讲解以下内容。
① 流程图中为了简化，仅画了一个马铃薯的原生质体与一个番茄的原生质体之间的融合，可真正在实际操作过程中，是把许多马铃薯的原生质体和许多番茄的原生质体放在一起，让它们自由融合，再从中筛选出所需的杂种细胞。
② 由于不同种的细胞其细胞膜的特点不一样，如不作任何处理，把它们放在一起，让它们自然融合是不可能的，所以原生质体间的融合必须要人工诱导。最后要特别强调植物体细胞杂交技术的意义，以及植物体细胞杂交已取得的进展和尚未解决的问题，使学生认同科学是一个不断发展的过程，激发学生探索生命科学奥秘的兴趣及勇于质疑的科学精神。
在植物繁殖新途径的教学中，首先可由植物组织培养技术引入，让学生回忆植物组织培养技术的基本原理和过程，思考利用这项技术能做哪些工作？再逐一讲解微型繁殖技术、作物脱毒及人工种子。
微型繁殖技术的特点教师需从教材中提炼出来：① 繁殖速度快；②“高保真”（因为是无性繁殖）；③ 不受自然生长季节的限制（因为在具有一定人工设施的室内生产）。
关于植物组织培养的其他应用，应当参照教材的思路，先介绍生产实践中遇到的问题，说明社会生产的实际需要，再介绍科技人员是如何应用植物组织培养技术解决这些问题的。例如，关于在作物脱毒中的应用，应当先介绍长期进行无性繁殖的作物，易积累感染的病毒，导致产量降低，品质变差，而植物的分生区一般不会感染病毒，用分生区的细胞进行组织培养，就能得到大量的脱毒苗。这样进行教学，一是能够让学生更好地理解先进技术的应用价值，二是能够调动学生的学习兴趣，三是有利于培养学生分析问题、解决问题的能力。
在细胞产物的工厂化生产的教学中，尽管此内容是植物组织培养技术在另一方面的重要应用，但由于学生对此内容易于理解，所以教师可先让学生阅读教材，再结合资料分析，师生共同讨论资料分析中的讨论题。
四、答案和提示
2.1.1植物细胞工程的基本技术
（一） 思考与探究
1.为什么“番茄―马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？
提示：<FONT face=楷体_GB年，梅尔彻斯（Melchers）等人首次获得了马铃薯与番茄的属间体细胞杂种。他们将培育的二倍体马铃薯品系和番茄叶片细胞进行融合，所产生的杂交株被称为“马铃薯番茄”。像大多数杂种一样，杂交株同时具有马铃薯和番茄的形态特征。其中一些植株形成了“类似块茎的生殖根”，但是没有产生可结实的花、果实以及真正意义上的块茎。到目前为止“马铃薯―番茄”一类的体细胞杂交植物还不能产生经济效益，但是其研究价值不可忽视。
至于马铃薯―番茄没有像人们预想的那样地上长番茄、地下结马铃薯，主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯―番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。
2.自然界中有一种含有叶绿体的原生动物──眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。
提示：根据眼虫的特点，动物细胞和植物细胞之间在理论上是可以实现杂交的。具体的实验方案可以设计如下：
（二） 正文中讨论题
【实验 胡萝卜的组织培养】
1.在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？
提示：植物组织培养中用到的培养基含有丰富的营养成分，有利于培养物的生长，然而各种杂菌同样也可以在上面迅速生长，所以植物组织培养过程中污染现象经常发生。培养基一旦被污染，迅速生长的各种杂菌不但会和培养物争夺营养，而且这些杂菌生长的过程中会生成大量对培养物有害的物质，导致培养物迅速死亡。
造成培养基污染的因素有很多，一般包括：外植体带菌、培养瓶和各种器械灭菌不彻底、操作人员操作不规范等。所以在组织培养实验中用到的植物材料和各种器械都要进行彻底地灭菌，实验人员操作一定要规范，避免带入杂菌。
2.在本实验中，切取胡萝卜块根时强调要切取含有形成层部分，原因是这部分容易诱导形成愈伤组织。请思考一下，胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花），是否也能培养成小植株，你能用实验的方法进行验证吗？
提示：胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花）也能培养再生形成小植株，只是诱导愈伤组织比较困难。可以让学生参考利用胡萝卜根进行组织培养的实验，尝试设计出利用胡萝卜的茎、叶、花进行组织培养的实验流程。
3.请根据上面的实验过程，概括出植物组织培养技术的流程简图。
2.1.2植物细胞工程的实际应用
（一） 思考与探究
1.通过查阅资料，请你再列举出植物组织培养技术在我们生活中的另外一些应用。
提示：a. 拯救濒危植物；
&&&&& b. 提供食品制作的原料；
&&&&& c. 利用愈伤组织进行转基因操作。
2.请查阅植物人工种子制备技术的详细过程，设计出制备技术的主要流程图。
提示：诱导植物愈伤组织
　　　　　　↓
　　　体细胞胚的诱导
　　　　　　↓
　　　体细胞胚的成熟
　　　　　　↓
　　　体细胞胚的机械化包裹
　　　　　　↓
　　　　贮藏或种植
3.请查阅相关文献，设计出一种植物花药组织培养和染色体加倍的实验流程。
花药花粉细胞培养愈伤组织分化出小植物单倍体植株正常植株
（二） 正文中讨论题
1.人们利用植物的微型繁殖技术来进行工厂化育苗生产，这是利用了该项技术的哪些特点？
提示：植物“微型”繁殖技术具有高效性和可以保持种苗的优良遗传特性的优势。工厂化大规模育苗生产正是利用了植物“微型”繁殖技术的这两方面优势。利用植物“微型”繁殖技术我们可以在短时间中获得大量的优质种苗。
2.人工种子之所以神奇，是由于它具有天然种子不可比拟的特点，想一想它们具有哪些优点？
提示：人工种子的优点：
（1）天然种子由于在遗传上具有因减数分裂引起的重组现象，因而会造成某些遗传性状的改变；天然种子在生产上受季节限制，一般每年只繁殖1～2次，有些甚至十几年才繁殖一次。而人工种子则可以完全保持优良品种的遗传特性，生产上也不受季节的限制。
（2）试管苗的大量贮藏和运输也是相当困难的。人工种子则克服了这些缺点，人工种子外层是起保护作用的薄膜，类似天然种子的种皮，因此，可以很方便地贮藏和运输。
3.人工种皮是保证包裹在其中的胚状体顺利生长成小植株的关键部分，请探讨人工种皮中应该具有的有效成分是什么？为了促进胚状体的生长发育，我们还可以向人工种皮中加入哪些物质？
提示：针对植物种类和土壤等条件，在人工种子的包裹剂中还可以加入适量的养分、无机盐、有机碳源以及农药、抗生素、有益菌等。为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些植物生长调节剂。
4.高效抗癌的药物紫杉醇，虽然能造福人类，但却为濒危的红豆杉带来一场灭顶之灾。以“我们能否利用植物组织培养技术大量生产紫杉醇，从而拯救红豆杉”为题，与同学展开讨论，说出植物组织培养技术在节约资源、保护环境方面的重要意义。
提示：可以利用植物组织培养技术来大量生产紫杉醇。现在国内外的科学家们正在研究利用植物细胞培养技术来大量培育红豆杉细胞，希望利用这种方法来大量生产紫杉醇。国内外许多实验室开展了用组织培养法生产紫杉醇的研究，红豆杉属的11种植物现都在进行组织培养。ESC Agenetics公司宣布他们用细胞培养法所得紫杉醇的含量是树皮的2～5倍。国内外在分化细胞株系和培养条件方面做了不少工作，摸索了外植体、光照、培养基组成等因素对细胞培养及紫杉醇生成的影响。现在工艺条件已基本摸清，正研究反应的放大技术等，有望实现通过细胞培养进行工业化生产紫杉醇的目标。
五、知识拓展
1.什么是细胞全能性?
细胞全能性（cell totipotency）比较权威的定义是1984年国际组织培养协会做出的：“细胞全能性为细胞的某种特征，有这种能力的细胞保留形成有机体所有细胞类型的能力”。这个定义比一般所说的概念“一个细胞中包含着这种生物的全部遗传信息（基因），在适当的条件下可以发育成一个完整的生物体”更基本和全面。它不但包含了培养细胞再生成植株的情况（分化成各种类型的细胞，并以一定形式构建成植物），同时也包含了培养细胞生产次生代谢物的情况（不分化或只分化成某种类型细胞，但仍留着分化为其他细胞类型的能力）。前者成为组织培养和转基因植物需要进行植株再生的理论基础，后者成为像微生物发酵一样培养细胞，生产人们所需要的次生代谢产物的理论基础，如通过红豆杉的细胞培养生产紫杉醇。
2.植物组织培养技术是如何发展起来的？
技术和理论是一对孪生兄弟，相辅相成，技术手段的发明会促进理论的创新，理论的创新又会指导技术的实践活动。植物组织培养也是如此。
早在1902年，哈伯兰特（Haberlandt）提出高等植物的器官和组织可以不断地分割，直至单个细胞的观点，预言植物体细胞在适宜的条件下，有发育成完整植株的潜力，提出了植物细胞全能性的设想，并且用植物细胞组织进行了培养实验。他虽然未能获得再生植株，却是植物组织培养的开创者。1902年他发表了著名论文《植物细胞离体培养实验》，论文中提出的植物细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。
从哈伯兰特提出植物细胞全能性的理论，到1958年斯图尔德（F.C.Steward）等人第一次用胡萝卜根的韧皮部细胞证实了植物细胞的全能性，用了整整56年。56年中许多科学家做的事情归纳起来都是在探索哈伯兰特提出的“植物细胞在适宜条件下，有发育成完整植株的潜力”中的适宜条件。
20世纪60年代以后，植物组织培养进入了迅速发展阶段，并逐步走向生产应用，如快繁脱毒、单倍体育种、种质资源保存、生产次生代谢产物等，也为人工种子、细胞融合、转基因植物等奠定了基础。
3.怎样制备胡萝卜培养基（供参考）？
（1）诱导胡萝卜愈伤组织
在MS培养基［注］中加入质量分数为0.5 mg/L的6-BA和质量分数为0.5 mg/L的NAA
（2）诱导胡萝卜丛芽
在MS培养基中加入质量分数为2 mg/L的KT和质量分数为0.2 mg/L的NAA
（3）诱导胡萝卜生根
在1/2MS培养基中加入质量分数为0.1 mg/L的NAA
［注］：MS培养基的配制方法见《选修1附录3中八》。
（鲍平秋提供）
4.植物组织培养中的愈伤组织是如何形成及再分化的？
植物组织培养中使用的外植体一般是高度分化了的细胞，在植物体中是不会再分裂繁殖的，只是执行某种功能直至死亡。这些细胞在培养基上培养时会由原来的分化状态，变成分生状态的细胞，分裂产生愈伤组织，这个过程称为脱分化（dedifferentiation）过程。这种转变在细胞的形态结构和生理生化上都会产生一系列变化。组织培养的研究结果表明分化细胞的脱分化需要两个条件，即创伤和外源激素。
目前人们对于脱分化过程的本质还不清楚。分化细胞在细胞周期中是处于一种相对静止状态的细胞（G0期细胞），脱分化是要打破这种状态，使细胞进入细胞周期中的G1期，并沿着G1期→S期→G2期→M期的循环进行细胞分裂，形成愈伤组织。现在发现细胞周期受基因调控，一种称为编码细胞周期依赖性激酶CDK（cycilin dependent kinase）的基因和一种细胞周期蛋白（cyclin）可能与植物细胞脱分化的第一次分裂启动有关。那么，什么因素诱导细胞周期调控基因的作用，培养实践证明与外源激素有关。至于激素如何诱导以及诱导作用的过程目前仍不清楚，有待深入研究。分化细胞脱分化后细胞结构有两点明显的变化：一是在细胞内出现液泡蛋白；二是叶绿体转变成原质体。
当细胞脱分化形成愈伤细胞后，经过一段时期的分裂，细胞群体变成不是一种细胞类型的均一群，又会产生分化，形成分生细胞或分生细胞团，由此再生成植株有两条途径：一是形成体细胞胚（功能类似于受精过程产生的胚），通过体细胞胚形成再生植株。二是走器官发生的途径再生植株，分生细胞在一定的诱导条件下重建芽的分生组织，分化出芽后再生根，成为完整的植株。
5.为什么要在避光条件下培养愈伤组织？
对于植物组织培养来说，光照条件非常重要，包括光照强度、时间和波长。但在愈伤组织的诱导阶段往往要暗培养，而在分化再生的过程中一定要有光照。愈伤组织诱导阶段的暗培养有利于细胞的脱分化产生愈伤组织，如果在光照条件下容易分化产生维管等组织，不利于产生大量的愈伤组织。
6.什么是人工种子？
人工种子（artificial seed）是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面包被着特定的物质，在适宜的条件下可以发芽成苗的植物幼体。人工种子的概念中包含的“具有正常发育能力的材料”通常是指胚状体（目前国外有使用不定芽、顶芽和腋芽的），它可以由三种途径产生：
（1）由已脱分化的外植体直接产生；
（2）由愈伤组织产生；
（3）由悬浮细胞培养产生。对胚状体的基本要求是：①播种后能快速出苗；②根和芽几乎同时生长，不产生愈伤组织；③同步化程度高；④活力强；⑤形成的幼苗的形态与生长要正常。
“外面包被着特定的物质”是指人工种皮，制作人工种皮的材料有海藻酸钠、明胶、树脂、琼脂糖、淀粉等。对人工种皮的要求是：能保持胚状体的活力，有利于贮藏运输和萌发。选取的材料要有韧性，耐压，对胚状体无毒害，含有胚状体发芽所需要的营养成分或植物激素，还应含有杀菌剂，以防播种后微生物的侵害。
人工种子目前还存在不少问题。例如，现有重要经济价值的植物产生胚状体能力弱，难以形成同步化的有强活力的胚状体；成本较高；运输贮藏以及机械化播种问题也未解决。因此，现在很少有人以生产为目的进行人工种子的研制。
7.植物微型繁殖技术高效快速的实例有哪些？
植物脱毒（virus-free）和离体快繁（in vitro propagation）是目前植物组织培养应用最多、最有效的方面。生产上许多无性繁殖作物均受到病毒的侵染，从而导致品种的严重退化、减产和降低品质。利用植物分生组织进行培养可以使新长成的植株脱去病毒。利用这种方法生产无病毒苗的农作物有马铃薯、甘薯、大蒜、草莓、苹果、香蕉等，并已大规模应用于生产。离体快繁技术可以使一些植物的扩增速度比常规方法快数万倍乃至百万倍，而且产生的幼苗遗传背景均一，重复性好，不受季节和地区限制。目前世界上已建成很多年产百万苗木的组培工厂，成为一种新兴产业。离体快繁技术在观赏植物、园艺植物、经济林木和无性繁殖作物上已得到广泛应用。
8.植物体细胞杂交的过程是怎样的？
体细胞杂交是克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离、扩大遗传重组范围的一种手段。操作过程包括：原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞筛选、杂种细胞培养、杂种植株再生以及杂种植株鉴定等步骤。
原生质体制备是用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶将植物细胞壁分解掉，只留下细胞膜（质膜）包裹着细胞内含物。原生质体融合是指两个原生质体的质膜重新组合排列形成一个质膜，其中含有两个细胞核。在细胞工程中一般是诱导融合，形成的融合细胞中所含有的两个细胞核是来自不同的物种，称之为异核体（heterokaryon）。诱导融合的手段有化学诱导和物理诱导。在诱导因素的作用下形成的融合细胞进一步产生核融合，进行第一次有丝分裂。杂种细胞的筛选方法有：①细胞系互补的选择方法，包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补和抗性互补等；②利用物理特异性差异的选择方法：这是利用两个原生质体物理特异性差异的一种选择，包括原生质体的大小、颜色、浮密度等的不同来选择；③利用生长特异性差异的选择方法。需要注意的是上述选择方法只适合部分杂交细胞的情况，有时无法选择，就不加选择地进行培养和再生成植株，然后对再生植株的杂种性状进行鉴定。杂种细胞培养方法与原生质体的培养方法相似。体细胞杂种的鉴定方法有：①形态学鉴定。利用杂种植株与双亲在表现型上的差异进行比较分析，如叶片大小与形状，花的形状与颜色、叶脉、叶柄、花梗及表皮毛有无等；②细胞学鉴定。杂种植株细胞中的染色体数目是否比任何一方亲本细胞中的染色体数目增多？理论上讲如果染色体不丢失，杂种细胞中染色体数目应为双亲染色体数目之和。也可以用基因组原位杂交的分子细胞学方法进行鉴定；③同功酶鉴定。同功酶是功能相同的酶的多重分子形态，它们是特异基因的产物。杂种细胞中的同功酶谱一般是双亲酶谱之和，但有时也会出现双亲没有的新带；④分子生物学鉴定。常用的方法有限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）和扩增片段长度多态性（AFLP）等。
值得注意的是体细胞杂交尚存在一些问题：①亲缘关系越远，染色体排斥丢失的现象就越严重；②由于是两个物种的全部遗传物质的合并，各种基因都在其中，选择符合需要的个体难度大；③有时缺乏选择杂种细胞的有效方法。因此目前整体对称融合的工作比较少，而是采用非对称融合，即一方亲本包括了全部遗传物质，另一方亲本只取一部分遗传物质，如用不具有核的原生质体与之进行融合。
9.物理和化学方法诱导原生质体融合的基本原理是什么？
化学融合的机制：常用化学融合方法有高pH―高Ca2+法和聚乙二醇（PEG）法。高pH―高Ca2+法诱导原生质体融合的基本原理是中和原生质体表面所带的电荷，使原生质体的质膜紧密接触，从而有利于质膜的接触融合。PEG处理原生质体可以使原生质体聚集促进融合，但PEG诱导融合的真正机制目前并不清楚。
物理融合的机制：常用方法为电融合法。此法是先将两种原生质体以适当的比例混合成悬浮液，将其滴入电融合小室中，给小室两极以交变电流，使原生质体沿电场方向排列成串珠状，接着给以瞬间高强度的电脉冲，使原生质体膜产生局部破损而导致融合。
10.工厂化生产人参皂甙的基本过程是什么？
第一步，选择人参根作为外植体进行培养，产生愈伤组织，经过培养选择找到增殖速度快而且细胞内人参皂甙含量高的细胞株作为种质，其中一部分作为保存用，以备下一次生产用，一部分进行发酵生产。
第二步，将第一步选择到的细胞株在发酵罐中的适合培养液中进行液体培养，增加细胞数量。
第三步，将发酵罐中培养的细胞进行破碎，从中提取人参皂甙。
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