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抗逆相关转录因子基因GmDREB3转录水平调控机制.pdf85页
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山东农业大学硕士学位论文
（dehydration
resistance
protein ）类转录因子是一类与抗逆
相关的转录因子基因，广泛存在于各种植物中，参与调控各种与抗逆相关的功能基因
的表达，在逆境胁迫应答反应过程中发挥非常重要作用。但是，目前对DREB 基因的
研究主要集中在功能分析方面，对其转录水平的调控机制了解比较少。
本实验室前期已经从大豆中克隆到新的GmDREB3基因，功能研究表明，过表达
GmDREB3基因可以显著提高植物的抗逆性。将GmDREB3启动子分段缺失融合GUS报
告基因采用基因枪转化小麦成熟胚愈伤组织，利用瞬时表达的方法检测不同长度启动
子的活性的方法，对GmDREB3启动子进行初步分析证明，在启动子的-705~-1117bp
区域存在着低温和干旱响应的正调控元件，在-bp 区域存在着对低温和干
旱响应的负调控元件。在此基础上，进一步对这两个重要区域进行了细致分析，结果
证明在-705~-731bp区域存在着对低温和干旱响应的正调控MYB元件；-
区域存在着对低温和干旱响应起重要作用负调控MYC元件。本研究中我们利用确定
的重要调控元件分别构建了诱饵载体，采用酵母单杂交技术，分别筛选与重要调控元
件结合的上游调控蛋白：运用MYC元件做诱饵筛选到了GmERF蛋白，运用MYB元件
作诱饵筛选到了GmMYB蛋白。我们分别采用酵母单杂交技术和凝胶迁移率实验验证
了MYC 元件与ERF 元件可以和GmERF 蛋白结合，MYB 元件可以和GmMYB 蛋白结
合；通过酵母转化验证GmMYB蛋白具有转录激活活性，而GmERF蛋白不具有转录
激活活性。通过RT-PCR对低温处理不同时间的拟南芥中的
正在加载中，请稍后...第9章 原核生物基因表达的调控教案
第9章 原核生物基因表达的调控
本章教学要求
1. 掌握基因表达的主要特点及主要表达方式。
2. 掌握原核基因表达调控的基本原理。
3. 掌握乳糖操纵子结构，熟悉其调节机制（包括阻遏蛋白负性调节、CAP正性调节及协调调节三个概念）。
4. 熟悉色氨酸操纵子的结构及其调控模式，了解其他转录调节机制。
本章教学的重点和难点
乳糖操纵子的结构及其调控模式：阻遏蛋白负性调节、CAP正性调节及协调调节；色氨酸操纵子的结构及其调控模式。
教学方法与手段
讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。
9.1 基因表达调控的基本概念
9.1.1 基因表达的概念
基因表达（gene expression） ：是指储存遗传信息的基因经过转录、翻译合成特定蛋白质，进而发挥其生物功能的整个过程。也即基因转录及翻译的过程。对这个过程的调节就称为调控（gene regulation）。
rRNA、tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达。
9.1.2 基因表达的方式
（一）组成性表达(constitutive expression)
1、概念：又称组成性基因表达(constitutive gene expression)是指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达。其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的，且较少受环境因素的影响。这类基因通常被称为管家基因（housekeeping gene）。
&①不易受环境变化影响,表达产物是整个生命过程中都持续需要的,是细胞存活所必须的。&&
&②表达水平较恒定。
3. 意义&& 维持生命
(二)适应性表达(adaptive expression）
&& 1.概念: 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。包括：
&①诱导—随环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction)，这类基因被称为可诱导的基因(inducible gene)；
&②阻遏--相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为可阻遏的基因(repressible gene)。
2.特点& 易受环境变化影响
3.意义& 适应环境
9.1.3 基因表达的时间性和空间性
1、时间特异性（temporal specificity）
图8-1按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性。
多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性(stage specificity)。
2、空间特异性(spatial specificity)
是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段，同一基因的表达在不同的细胞或组织器官不同，从而导致特异性的蛋白质分布于不同的细胞或组织器官。故又称为细胞特异性或组织特异性(cell or tissue specificity)。&
9.1.4 基因表达调控的生物学意义
适应环境、维持生长和增殖（原核、真核）
维持个体发育与分化（真核）
9.1.5 基因表达调控的基本原理
（一）基因表达的多级调控
基因表达调控可见于从基因激活到蛋白质生物合成的各个阶段，因此基因表达的调控可分为
转录水平（基因激活及转录起始）
转录后水平（加工及转运）
翻译后水平
但以转录水平的基因表达调控最重要。
（二）基因转录激活调节&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&& 基本要素
1．顺式作用元件（cis-acting element）：又称分子内作用元件，指存在于DNA分子上的一些与基因转录调控有关的特殊顺序。
在原核生物中，大多数基因表达通过操纵子模型进行调控，其顺式作用元件主要由启动基因、操纵基因和调节基因组成。
在真核生物中，与基因表达调控有关的顺式作用元件主要有启动子（promoter）、增强子（enhancer）和沉默子（silencer）
2．反式作用因子（trans-acting factor）
又称为分子间作用因子，指一些与基因表达调控有关的蛋白质因子。 反式作用因子与顺式作用元件之间的共同作用，才能够达到对特定基因进行调控的目的。
原核生物中的反式作用因子主要分为特异因子、激活蛋白和阻遏蛋白；
而真核生物中的反式作用因子通常称为转录因子。
3．顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用
大多数调节蛋白在与DNA结合之前，需先通过蛋白质-蛋白质相互作用，形成二聚体或多聚体，然后再通过识别特定的顺式作用元件，而与DNA分子结合。这种结合通常是非共价键结合。
9.2 原核基因调控机制
9.2.1 原核基因表达调控环节
1、转录水平上的调控
（transcriptional regulation）
2、转录后水平上的调控
（post-transcriptional regulation）
&&&&&& ①&mRNA加工成熟水平上的调控
&&&&&& ②&翻译水平上的调控
9.2.2 操纵子学说
1、操纵子模型的提出
1961年，Monod和Jacob提出，获1965年诺贝尔生理学和医学奖
2、操纵子的定义
操纵子是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。
9.2.3 原核基因调控机制的类型与特点
1、根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的应答，可分为：
正转录调控：在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的调控成为正转录调控。
负转录调控：在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调控称为负转录调控。
2、根据操纵子对某些能调节它们的小分子的应答，可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类：
可诱导调节（P238）：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。
&&& 例：大肠杆菌的乳糖操纵子
&诱导物：如果某种物质能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱导物 。
可阻遏调节（P238）：基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。即在某些物质的阻遏下使基因关闭。
&&& 例：色氨酸操纵子
&&& 合成代谢蛋白的基因
酶合成的阻遏操纵子模型
3、在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录的作用。
&& 根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏：
在负控诱导系统中，阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因转录；
在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。
在负控诱导系统中，阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因转录；
在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。
4、在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）。
& 根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导和正控阻遏
在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；
在正控阻遏系统中，效应物分子（辅阻遏物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。
在正控诱导系统中，效应物分子(诱导物)的存在使激活蛋白处于活性状态；
在正控阻遏系统中，效应物分子(辅阻遏物)的存在使激活蛋白处于非活性状态。
9.2.4 转录水平上调控的其他形式
1、σ因子的更换
& 在E.coli中,当细胞从基本的转录机制转入各种特定基因表达时，需要不同的s因子指导RNA聚合酶与各种启动子结合。
大肠杆菌中的各种σ因子比较
温度较高,诱导产生各种热休克蛋白
& 由σ32参与构成的RNA聚合酶与热休克应答基因启动子结合,诱导产生大量的热休克蛋白,适应环境需要
枯草芽孢杆菌芽孢形成
& 有序的σ因子的替换,RNA聚合酶识别不同基因的启动子,使芽孢形成有关的基因有序地表达
2、降解物对基因活性的调节
3、弱化子对基因活性的影响
9.3 乳糖操纵子(lac operon)
9.3.1 乳糖操纵子的结构
乳糖操纵子的结构
乳糖操纵子的结构
1) 结构基因：
&& 分解乳糖的三种酶，使乳糖分解，产生能量。
2) 操纵基因
5)&&i基因：上游，产生阻遏物。
Z编码β-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖
Y编码β-半乳糖苷透过酶：使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。
A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。
9.3.2 酶的诱导??lac体系受调控的证据
义务诱导物 (gratuitous inducer)：如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为义务诱导物，如IPTG（异丙基- β –D-硫代半乳糖苷）。
9.3.3 乳糖操纵子调控模型
主要内容：
① Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码
② 这个mRNA分子的启动子紧接着O(operater，操纵基因)区，而位于I与O之间的启动子区（P），不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。
③ 操纵基因(operater)是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。
④当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制。⑤诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lac mRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。
（一）阻遏蛋白的负性调节：
&&&& （分解代谢）——可诱导调控
1) 无乳糖存在时，阻遏物可以结合在操纵基因上—→阻止转录过程—→基因关闭
2)&有乳糖存在时，乳糖与阻遏物结合—→阻遏物变构—→阻遏物不能结合操纵基因—→转录进行—→基因开放
可诱导调控的操纵子，其基因表达产物都是利用某种营养物的酶体系（分解代谢）
&&&&& 有营养物 ——相应基因开放
&&&&& 无营养物 ——细胞就没必要产生相应的酶
（二）CAP的正性调节
1．调控机理：
代谢物激活蛋白（CAP）/ 环腺甘酸受体蛋白（CRP）
细菌中有一种能与cAMP特异结合的环腺甘酸受体蛋白 (cAMP&receptor&protein,CRP)
当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的；
当cAMP浓度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为代谢物激活蛋白 (Catabolite Activator Protein, CAP)，能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。
在lac操纵元的启动子Plac上游端有一段与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点(CAP&binding&site)。
CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。
相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP不能被活化，lac操纵元的结构基因表达下降。
CRP + cAMP —→复合物CAP—→结合在CAP的结合位点上—→促进RNA pol向前移动
2、CAP正调控的意义
葡萄糖、乳糖同时存在时，葡萄糖先利用
1）有葡萄糖存在时，cAMP↓—→cAMP + CRP形成复合物↓，不能结合CAP位点上，—→正调控作用↓—→乳糖操纵子不能表达。
（虽然有乳糖存在，乳糖操纵子不开放基因）
2）无葡萄糖存在时，cAMP↑—→CAP↑—→正调控作用—→基因表达。
可见，对lac操纵子来说CAP是正性调节因素，lac阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节lac操纵子的表达。
（三）协调调节
当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用
&如无CAP 存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。 cAMP—CAP 复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。
&单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/ 乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。
&葡萄糖对 lac& 操纵子的阻遏作用称为分解代谢阻遏(catabolic repression) 。
9.3.4 影响因子
1、lac操纵子的本底水平表达
有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的：
①诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成有需要诱导。
解释：一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞？
&&&& 一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？√
②真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在β-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有β-半乳糖甘酶的预先存在。
本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。
2、大肠杆菌对乳糖的反应
培养基：甘油
& 按照lac操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷透过酶；
培养基：加入乳糖
诱导物的加入和去除对lac mRNA的影响
3、阻遏物lac I基因产物及功能
& Lac 操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的，每个细胞中有5-10个阻遏物分子。
&& 当I基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些突变体中就不可诱导。
4、葡萄糖对lac操纵子的影响
&& 如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，lac操纵子处于阻遏状态，不能被诱导；一旦耗尽外源葡萄糖，乳糖就会诱导lac操纵子表达分解乳糖所需的三种酶。
&&& ????代谢物阻遏效应
5、cAMP与代谢物激活蛋白(P239)
&细菌中的cAMP 含量与葡萄糖的分解代谢有关：
当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；
相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。
大肠杆菌中：无葡萄糖，cAMP浓度高；
&&&&&&&&&&& 有葡萄糖，cAMP浓度低
CAP的正调控
9.4 色氨酸操纵子（trp operon）
色氨酸是构成蛋白质的组分。
一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸。
但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。
细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元(trp&operon)的调控。
9.4.1 色氨酸操纵子的结构
&(1) trpR和trpABCDE不连锁；
&(2) 操纵基因在启动子内
&(3) 有衰减子(attenuator)/弱化子
&(4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被
&&&&& 前导序列(Leader)所隔开&
9.4.2& trp 操纵子的阻遏系统
阻遏物不结合操纵基因;
阻遏物+Trp&&& 结合操纵基因
trp 操纵子的阻遏系统
9.4.3 &trp 操纵子的弱化机制
衰减子（attenuator）/弱化子
前导序列（leader sequence）
现象：实验观察表明：当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。
机制：仔细研究发现这种调控现象与色氨酸操纵元特殊的结构有关。
1、弱化子：
& DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列（123-150区）。
& 研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。
2、前导序列
在trp mRNA5端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。
3、弱化机制
如果当其他氨基酸短缺(注意：短开放读框编码的14肽中多数氨基酸能由环境充分供应的机会是不多的)或所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据1的序列，
结果有利于1和2、3和4发夹结构的形成，于是RNA聚合酶停止转录，等于告诉细菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能量&”。?
b)Low tryptophan levels
当色氨酸浓度低时，生成的tRNAtrp就少，核糖体在序列1的trp密码子处暂停，序列2和3之间形成配对结构，阻止了衰减，因为序列3不再与序列4之间形成衰减结构，RNA聚合酶得以沿DNA前进，继续去转录其后trpE等基因，trp操纵元就处于开放状态。
c) High tryptophan levels
当色氨酸浓度增高时，tRNAtrp浓度随之升高，核糖体快速翻译序列1(前导肽阅读框)，占据到2的机会增加，1和2生成发夹结构的机会减少，3和4形成类似终止子的衰减子结构的机会增多，导致RNA聚合酶终止转录。
细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停下来。
阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少；弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少，它通过前导肽的翻译来控制转录的进行。
在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。
在trp操纵元中，对结构基因的转录，阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用，而衰减子起到细调的作用。
细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵元(如组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵元)中也有类似的衰减子存在。
9.5 其他操纵子
9.5.1 半乳糖操纵子(galactose operon)
异构酶(galE)
乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT)
半乳糖激酶(galk)。
gal操纵子的结构
gal操纵子的特点：
① 它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录；
② 它有两个O区，一个在P区上游，另一个在结构基因galE内部。
9.5.2 阿拉伯糖操纵子（arabinose operon)
araB基因、araA基因和araD, 形成一个基因簇，简写为araBAD
三个基因的表达受到ara操纵子中araC基因产物AraC蛋白的调控。
ara操纵子的调控有两个特点：
第一，araC表达受到AraC的自身调控。
第二，AraC既是ara操纵子的正调节蛋白（需cAMP-CRP的共同参与，起始转录），又是其负调节蛋白。这种双重功能是通过AraC蛋白的两种异构体来实现的（Pi和Pr)。
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