 下载
 收藏
该文档贡献者很忙，什么也没留下。
 下载此文档
正在努力加载中...
离子交换柱层析原理
下载积分：1662
内容提示：离子交换柱层析原理,离子交换,柱,层析,原理
文档格式：DOC|
浏览次数：1|
上传日期： 07:07:23|
文档星级：
该用户还上传了这些文档
下载文档:离子交换柱层析原理.DOC
官方公共微信蛋白质的离子交换层析_分子.细胞_科研新知_资讯_生技网-搜尽生命科学！
蛋白质的离子交换层析
发布日期：&&来源：生技网信息中心&&浏览次数：2943
&&& 离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯 &&& 离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
（一）原理
&&& 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
&&& 溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为 球蛋白， 球蛋白和 球蛋白。
&&& 在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。
&&& 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。
（二）常用离子交换剂的种类与特性
&&& 1.离子交换纤维素& 离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。
表1-1 离子交换剂的类型与特点
名&& 称（纤维素）
作 用 基 团
特&&&&& 点
二乙氨基乙基
DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H
最常用在pH8.6以下
三乙氨基乙基
DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H
AE+-O-C2 H4-N H2
强碱性、极高pH仍有效
CM—-O-CH2-COO—
最常用在pH4以上
P－-O- P O2－
SM－-O-CH2-SO3－
SE－-O-C2H4-SO3－
强酸性用于极低pH
&&& 在交换纤维素中，最常用的是DEAE—纤维素和CM纤维素。由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异。一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表1－2）。
表1-2 商品DEAE—纤维素和C M纤维素的类型和特性
（毫克当量/克）
蛋白质吸附容量
（mg /g牛血清白蛋白）
床体积（ml / g）
（除细粒）
微粒型（干）
微粒型（湿）
与以上相应
&&& 离子交换纤维素的优点为：①离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量最大；②离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；③具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广。
2．离子交换交联葡聚糖& 离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子交换纤维素不同点是载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表1-3。
表1-3 常用交联葡聚糖的类型与特性
总交换容量
（毫克当量/g）
DEAE-sephadexA-25
弱碱性、阴离子交换剂
DEAE-sephadexA-50
QAE-sephadex-25
弱碱性、阴离子交换剂
QAE-sephadex A-50
CM-A- sephadex 25
弱碱性、阳离子交换剂
CM- sephadex A-50
SP- sephadex A-25
强碱性、阳离子交换剂
SP- sephadex A-50
&&& 离子交换交联葡聚糖有如下优点：①不会引起被分离物质的变性或失活；②非特异性吸附少；③交换容量大。
&&& 离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般选A50和C50，而低分子量（＜30 000和高分子量＞200 000）均宜选用A25和C25。
（三）试验方法
&&& 阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。
1．剂型的选择& 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。
&&& 下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法
2．膨胀活化& 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。
表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系
血清样品量（ml）
DEAE需用量（g）
选层析柱规格（cm）
选脱液量（ml）
&&& 称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。
3．平衡& 将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。
4．装柱& 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10︰1～20︰1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。
&&& 装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。
5．上样& 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。
&&& 样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的 —球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。
6．洗脱& 对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使pH逐渐降低，而离子浓度逐渐升高。一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确。
表1－5 血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系
DEAE吸附能力
表1－6 血清的分段洗脱成分
NaCl浓度（Mol/L）
0.01Mol/L PB（pH）
运铁蛋白、纤维蛋白原
白蛋白、IgA
IgM& 白蛋白
表1－7 各种Ig解脱吸附条件
不加NaCl PB离子强度（Mol/L）
7．洗脱液的收集& 利用自动分步收集器收集，并以20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。
8．交换柱的再生& 将使用过的DEAE－纤维素移入烧杯中，用2Mol/L NaCl液浸泡，抽滤并洗涤数次。如不立即使用，可加1/10 000的叠氮钠防腐，保存于4℃冰箱中。使用时，再以碱－酸－碱处理。
欢迎投稿：，邮箱： news#biogo.net （#用@代替） 新闻热线：010-
&&相关评论离子交换凝胶柱层析(凝胶,离子交换,柱层析,交换剂)
18:18:30&&&来源：&&&评论：&&
离子交换凝胶柱层析(凝胶,离子交换,柱层析,交换剂)] 实验90 离子交换凝胶柱层析
在植物生理生化的研究中，往往要从一个组分复杂的混合物中，将性质很相近的生物大分子分离，这是研究工作中一个很关键的问题，需要一种具有高度分辨力的技术，才能满足这一要求。离子交换层析就是这样的技术，能够分离只有很小差异的物质（ [关键词:交换剂 凝胶 离子交换 柱层析 缓冲液 离子强度 蛋白质 洗脱]…
实验90 离子交换凝胶柱层析
在植物生理生化的研究中，往往要从一个组分复杂的混合物中，将性质很相近的大分子分离，这是研究工作中一个很关键的问题，需要一种具有高度分辨力的技术，才能满足这一要求。离子交换层析就是这样的技术，能够分离只有很小差异的物质（例如仅有一个氨基酸不同的两种蛋白质），是分离大分子的一种重要方法。由于差不多所有的生物大分子都是极性分子，都带有电荷。离子交换层析的基本原理即基于溶质分子所带的电荷，能使所带电荷稍有不同的分子分离。
进行离子交换层析的过程有两个主要阶段：第一阶段是加样和产生吸附作用过程，未被吸附的物质则从柱床上流失；第二阶段是物质从柱子上洗脱，彼此得到分离。发生分离作用是由于不同物质所带电荷不同，对离子交换剂有着不同的亲和力，亲和力的大小可以通过改变条件而加以调节，如通过改变离子强度和pH。
制备层析柱
1．选择离子交换剂
离子交换剂的种类很多，根据交换剂的功能基团可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，阳离子交换剂又分强酸型（如乙基磺酸，SE；丙基磺酸，SP），弱酸型（如羧甲基，CM）。用离子交换剂也有强碱型[二乙基—（2—羟丙基）氨基乙基，QAE]，弱碱型（二乙基氨基乙基，DEAE）。由于交换剂的母体（matrix）不同，又有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等类型。没有一种交换剂对所有物质的分离都是适用的，所以工作开始首先要选定交换剂的类型。要选择交换剂首先应根据分离物质的性质，例如要分离纯化酶，酶是一种蛋白质，蛋白质为两性物质，由于外界环境的pH不同，所带的电荷也不同。当pH值低于等电点时，蛋白质带正电荷，能结合在阳离子交换剂上，此时应选用阳离子交换剂；pH高于等电点时，带负电荷，无疑应选用阴离子交换剂。此外，还应考虑蛋白质的变性、酶的失活等，如果该酶在低pH时不稳定，这样就只能在高于等电点的PH条件下，选用阴离子交换剂进行分离，而不能在低于等电点的PH条件下，用阳离子交换剂进行分离。一般情况下分离的起始缓冲液的PH值总是高于或低于等电点1pH单位（此时应高于等电点1pH）。如果要分离的酶的等电点在文献上查不到，则可以通过简单的试验，确定起始缓冲液的pH值，其方法为：
(1)取数支，每管中加入0.1g葡聚糖凝胶离子交换剂（或其他类型离子交换剂）。
(2)各管用0.5mol/L缓冲液10ml使吸胀，然后用缓冲液洗10次，每次10ml，如为阴离子交换剂则所用缓冲液的pH范围为5─9，阳离子交换剂则用pH4─8，pH间距为0.5。
(3)用离子强度较低（0.01─0.05mol/L）pH值相同的缓冲液洗各管中的交换剂凝胶5次，每次10ml，使交换剂平衡稳定。
(4)在每管中加入一定量的样品（如要纯化的酶液），摇动5─15分钟，放置待胶粒下沉。
(5)取每管中的上清液进行分析（测定酶活性）。假如出现图40所示结果，在pH6.0─6.5之间酶蛋白被交换剂结合，这种情况下，起始缓冲液的pH应选用6.5，在该pH下被结合的蛋白质更容易从交换剂上释放，如果选用更高的pH，会给以后从交换剂上洗脱带来困难。
此外，还应该考虑交换剂的颗粒大小以及它的硬度，这些都会影响洗脱液的流速。交换剂的孔度虽然不会影响交换的机理，但因位于交换剂内部的功能基团，对大分子物质来说就无法利用，这样就会影响交换容量。另外，还应考虑样品的分子量，如分子量小于106
，可选用SephadexC─25或A—25；分子量在104 ─105
之间，则可选用SephadexC—50或A—50，或Sepharose（琼脂糖凝胶）、Sephacel（微晶纤维素）；分子量大于105
，选用Sepharose或Sephacel都是合适的；对于很大的分子，如分子量超过4×104 ，可用SephadexC—25或A—25，因为它们的微珠最小，在胶粒的表面，可取代的功能基团最多，有利于大分子物质在胶粒表面发生离子的交换。
2．选择缓冲系统
对于一个缓冲系统来说要考虑的是缓冲成分、离子强度及pH值。如果缓冲离子带的电荷与交换剂功能基团的电荷相反，它们将参与离子交换过程，使局部的pH发生变化。所以阴离子交换剂要用阳离子缓冲液（如Tris、吡啶、咪唑、铵、乙二胺、烷基胺、氨基乙醇等缓冲液）；阳离子交换剂则用阴离子缓冲液（如醋酸、柠檬酸、甘氨酸、磷酸以及巴比妥等缓冲液）。缓冲液的离子强度影响结合能力，离子强度低时对交换剂功能基团的竞争结合能力弱，所以蛋白质与交换剂的结合较强，增加离子强度则增加竞争作用，降低了交换剂与蛋白质的结合能力，结果将蛋白质从交换剂上洗脱。洗脱液的离子强度也可以通过试验确定（与上述选择起始缓冲液pH值的试验相似，用选定的起始缓冲液pH，以2
梍5×10-1 1mol/L NaCl进行测定）。当离子强度为0.1，pH处于等电点±0.5时，则该物质开始从离子交换剂上解离。
3．装柱、洗脱分离
层析柱的质量直接影响分离的效果，质量差的柱子会降低分辨能力，使峰变宽，流速不稳。在装柱过程中应特别注意不能有气泡进入，产生死体积，以避免已分离的组分重新混合。所以吸胀后的交换剂和配好的缓冲液，应该用抽除空气。交换剂凝胶用起始缓冲液充分吸胀（吸胀1梍2天），如果交换剂凝胶是瑞典Pharmacia
Fine Chemicals产品，直接用缓冲液吸胀即可。如果不是盐式剂型则需要事先用酸和碱作预处理，处理时避免剧烈搅动。柱子装好后至少要用2倍柱床体积的缓冲液流过交换剂，使达到平衡和稳定。样品中离子的组成应该与起始缓冲液相同，如果不同，可以通过在起始缓冲液中透析使其达到一致。如果以后用起始缓冲液洗脱，则加在柱上的样品量一般为柱床体积的1梍5%。如果用梯度溶液洗脱，则应使样品的重要组分，在柱子顶端被吸附，这时样品中组分的含量较样品的体积更为重要，大体积的稀样品不必经过浓缩就可以直接加到柱子上。
在通常情况下可用常液洗脱（即用起始缓冲液洗脱），这是最简单而方便的洗脱方式，不需要梯度仪，但分离的时间长些，分离效果也较差。目前用得更多的是浓度梯度洗脱，在洗脱过程中改变离子强度。前面已经提到过，增加离子强度则增加与交换剂上功能基团的竞争作用，降低了交换剂与样品组分的结合能力，结果将组分从交换剂上洗脱，浓度梯度洗脱方式可以提高分离的效果，也可缩短分离的时间。提高离子强度通过梯度装置（仪）连续不断地在缓冲液中加入浓度较大的NaCl来实现。用部分收集器将分离后的不同组分，分别收集在试管中，然后测定（如测定蛋白质含量或酶活性等）各试管中存在的各个组分。层析装置如图41所示。
4．层析柱的再生
经过层析分离后往往会有一些杂质污染交换剂凝胶或柱床的表面，必须处理除去。上样前应将样品离心或过滤，除去样品中的不溶物，以免污染柱床表面。对于已沉积于柱床表面的不溶物，可人工挖去表层交换剂，再适当补充一些新的。蛋白质、脂类等对交换剂的污染，可分别用0.1mol/L
NaOH和1mol/L NaCl洗涤，再用水洗至中性，然后用平衡。洗涤过程一般可在层析柱中进行。暂时不用的交换剂，加制成悬液，加入防腐剂，如0.02%叠氮钠、0.001%醋酸苯汞等，在冰箱中可贮藏一年左右。如用过的交换剂数量较大，则可进行干燥后保存。
将本文分享到下面的网站：
相关热词搜索：
离子交换凝胶柱层析(凝胶,离子交换,柱层析,交换剂)]延伸阅读：
频道总排行
频道本月排行离子交换柱层析技术操作 - 剪贴本
liuyinghuoyan的剪贴本
欢迎来访！您可以点击左上角的链接分别访问liuyinghuoyan的文档，书签，图片和摘要
剪贴本提供免费的网络“剪报”与“笔记”，构建个人知识库。您可以来
离子交换柱层析技术操作
离子交换柱层析技术操作
liuyinghuoyan
Mar 4, :19 AM
离子交换柱层析技术操作
1.处理：对被样品有时要经过水解等处理，样品溶液一般要兼顾到浓度与粘度两方面。
2.离子交换柱的安装：层析柱内径必须粗细均匀，柱管大小可据实际需要选择。柱下端胶塞中插入一放液管，胶塞上盖以园形尼龙绸或发泡塑料片以防止交换树脂流出。+ d- i) ]! e6 P+ A) z3 C; T2 b
3.装柱：⑴装柱质量是确保柱层析分离效果的关键之一，越是高技术层析(如使用毛细管层析柱的高级层析设备)装柱的技术要求和难度越高，以至手工操作很难达到。⑵装柱的质量要求，无论是手工、机械、自动化装柱都是一样的，要求装入柱中的分离载体材料松紧适度，分布均匀，无气泡、无断层、无结节，能保持正常的溶胀形态和结构；⑶装入柱中树脂的高度与直径之比因分离对象和分离目的不同而相差很大，本教材推荐的肝素钠洗脱柱装柱高度是柱径的4～6倍。⑷操作次序，以手工装入溶胀的D254树脂（湿法装柱）为例，其操作程序可概括为：①查连接(柱与塞之间、上下塞与进出液管之间、梯度混合器与进液管之间、出液管与收集器之间等等的连接是否正确、紧密)，②试止漏（塞子、接头、活塞开关处在长时间满负荷下不泄漏），③加隔离缓冲垫（紧贴于柱子下端塞子的内平面），④加少许平衡液于空柱内，⑤赶气泡（缓冲垫内和出水管中的气泡），⑥开通放水开关，⑦与放水量保持相当的流速，向柱内匀速加完载体材料浆，⑧关闭放水开关，令树脂自然下沉，⑨用洗涤液和清水洗涤树脂，⑩最后用缓冲液过柱和平衡柱，使树脂结构平衡稳定，⑾在树脂表面盖上一片尼龙或泡膜塑料，并与柱子内壁保持严密接触，以防加样时树脂泛起。
4.加样：缓缓打开柱子下端的放液开关,使柱内液面刚好降至树脂面时便立即将样品溶液小心地加到尼龙或泡膜塑料片上，待样品液面刚好进入树脂层内便立即加入少许平衡缓冲液,以清洗粘附在覆盖层中的样品，并随之进入树脂层。当柱内液位接近树脂表面时便立即添加洗涤液进行洗涤操作。
5.洗涤：选用合适的洗涤液、恰当的总用量及洗涤流速，小心洗涤柱内树脂，以除去不被离交树脂吸附的杂质。- K7 x- z3 B5 M+ U9 K! C
6.洗脱：由洗脱曲线找出洗脱液的最佳浓度和适当的总量、操作压及流速进行洗脱。" ?- S& B&&q7 Y! R- o# N
7.监测：用敏感快速的方法（参见下文“”）监测分离成分是否洗脱出来以及洗脱峰的轴向分布$ N2 E/ ?8 I7 [1 y: v7 A
8.收集：一旦发现待分离成分洗脱出来便可进行一步或分步收集，并可根据各成分洗脱峰的轴向分布和浓度监测，决定产品收集浓度区段，弃去的洗脱液可循环用于相同成分的洗脱。( [' T9 @, r0 F, }
9.沉淀/离心：用沉淀剂可将分离组分沉淀或离心下来脱水干燥，沉淀剂回收再用。
10.脱水干燥：加入适当脱水剂为如无水乙醇、丙酮或乙醚脱水后进一步干燥。. v' a% p5 w) `. v1 C6 R
11.测定：对层析所得产品可称重或测定活性计算其得量和收率。6 Z' t, A1 n1 z1 S
【注意事项】
1.应根据被分离物质的理化性质、分子大小、分子形状和分离的目的要求，选择分离效果好、交换容量大而机械强度较高的分离载体材料。市售的分离载体有明确的规格型号、理化性质、功能作用、活化再生和保养存放等技术参数资料可供用户选择。
2.应根据分离纯化的对象、规模选择层析柱的长短、粗细、柱高与内径之比，使达到最佳分离效果；此外，柱子材料的化学性质要稳定、透明，内径要均一、光滑，死腔要愈小愈好，要有利于紧固、连接、装柱与维护。
3.柱子安放要垂直、稳固，与之相连的各种线路、管道、设备、设施的布局和连接要紧奏，要方便操作、观察与维护。
4.要求装入柱中的分离载体材料松紧适度，分布均匀，无气泡、无断层、无结节，能保持正常的溶胀形态和结构。
5.保持柱内树脂层面平整、层序结构始终如一是确保柱层析分离效果的又一技术关键。为此，从装柱到洗脱结束的过程中，尤其是加样、洗涤、洗脱过程中要始终保持柱内液位不低于柱内树脂的顶部平面，尤其要始终保持柱内树脂的层序结构始终如一，不被打乱，特别要防止更换浓度不同的洗涤洗脱液时发生“翻缸”而搅乱树脂层结构，“压缸”而造成柱层断裂和梗塞断流。4 x. Z/ }& b2 ?+ x
6.注意保持一定的操作压，这对确保层析柱流速和分离效果十分重要。因为流速不仅与洗脱液加在柱上的压力（因液面差造成）有关，也与装柱材料的粒度、交联度、机械强度有关。应针对具体情况建立一个操作压、流速和分离效果的最佳平衡点。
6.显著标明各种洗涤、洗脱液的技术参数，严禁乱用和混用。" J4 H) R7 r- p! p, n( u: L' Q, X
7.制作洗脱曲线，确定洗脱液收集方案，设置洗脱监控点。, k8 j) B* F# E1 \+ C7 o' j: z
8.注意剔除破损树脂，及时补足流失、破损的循环树脂量。- V1 \: f! ^! E2 d! n' ]; t
9.严格掌握新、旧树脂的活化、再生条件，及时再生旧树脂。! e# g+ i' |7 t7 A& \
树脂的再生：每次洗脱结束，用清水将树脂洗出柱体再用、再生，或用高浓度的NaCl溶液浸泡贮存。树脂经过一段使用后树脂上的活性基团因被交换而使交换容量大为降低，此时树脂需要再生处理。
大处理（酸—碱—酸）：加入树脂2倍量的2mol HCL溶液搅拌3小时，自来水冲洗至中性；又用2mol NaOH溶液照酸处理方式处理；再用2mol HCL处理。5 ]9 ?0 m! ~" d3 U5 ^* x
小处理（碱—酸）：浓度、方法同上。
连续用数次的树脂进行小处理，用十次后的树脂要进行大处理。
10．注意脱水干燥条件。
【技术意义】
1.柱层析是将起分离分析作用的载体材料充填于柱子中的一大类层析技术，在医疗、制药、科研、环保、工农业生产中具有重要的技术地位和技术作用，得到了十分广泛，且越来越广泛的。
2.离子交换柱层析又是柱层析中的代表类，有着柱层析共同的理论基础、技术要求、技术过程和技术要领，通过系统学习离子交换柱层析技术不仅有利于全面掌握和熟练应用该技术，也为学习运用其他柱层析技术奠定了学习基础。5 ?' K4 O+ b0 z
3.为愿意深入学习此项技术，进行蛋白质（如γ球蛋白的分离纯化、鸡卵类粘蛋白的）、粘多糖（如肝素分离纯化）、酶（如大肠杆菌碱性磷酸酯酶制备）和核酸（如酵母mRNA的制备）自主性或综合性的学生提供实验前的技术培训。
【思考题】$ N5 {, T( j" X$ q8 J5 J- F
1、柱上吸附层析法与柱上分配层析法有何区别？纸上层析法的基本是什么？6 z# m5 A& l, K3 v4 Q$ L
2、如何选择吸附剂、溶剂和洗脱液？试以实例说明之。5 U* R: d) F! Q7 b$ S
3、使用离子交换树脂分离样品前，为什么必须先测定其交换容量？写出该测定过程的反应式。4 o" J" ?0 M; a% @9 R
4、未转型的树脂（或已用过的树脂）与已转型的树脂交换容量有何不同？
5、以制备无离子水为例，说明离子交换树脂工作的简单原理。
6、利用分子筛凝胶柱层析分离混合样品时，怎样才能得到较好的分离效果？! A/ q- O$ S: u# Y7 h&&T
7、离子交换纤维及离子交换葡聚糖凝胶在分离提纯酶及其他具有生物活性的大分子物质方面有何异同？
8、离子交换树脂使用多次后为什么需要再生？简述其再生过程。+ j/ ]6 L7 R, X+ [6 ?/ v' p: X
9、离子交换和凝胶层析湿法装柱时，如出现气泡、结节、表面凹凸不平，该如何处理？
加载中……
离子交换柱层析技术操作
1# 跳转到 & 倒序看帖 打印 字体大小: tT 发表于
12:44 | 只看该作者 [分享] 离子交换柱层析技术操作 1.样品处理：对被分离样品有时要经过水解等化学处理，样品溶液一般要兼顾到浓度与粘度两方面。 5 U8 W! C- v4 U/ s. k2.离子交换柱的安装：层析柱内径必须粗细均匀，柱管大小可据实际需要选择。柱下端胶塞...
剪贴本版权所有}